Ключевые ферменты биосинтеза пуринов в сетчатке млекопитающих : Особенности регуляции процесса в различных клетках

• Автор: Киян, Юлия Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 119 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Многообразие функций пуринов
1.2. Реакции биосинтеза пуринов
1.2.1. Фосфорибозилпирофосфат-синтетаза
1.2.2. Амидофосфорибозилтрансфераза
1.2.3. Другие ферменты биосинтеза пуринов
1.3. Особенности регуляции биосинтеза пуринов у E. coli,
в печени и мозге позвоночных
1.3.1. Регуляция биосинтеза пуринов у E
1.3.2. Особенности регуляции биосинтеза пуринов
в тканях позвоночных
1.3.3. Особенности биосинтеза пуринов в ткани мозга
1.4. Циркадианные ритмы в сетчатке
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы
2.2. Методы получения исследуемых препаратов
2.2.1. Получение препаратов амидофосфорибозилтрансферазы и фосфорибозилпирофосфат синтетазы из сетчаток крупного рогатого скота
2.2.2. Получение препаратов наружных и внутренних
сегментов палочек
2.2.3. Получение субклеточных фракций
2.3. Общие методы исследований
2.3.1. Измерение активности амидофосфорибозилтрансферазы
2.3.2. Измерение активности фосфорибозилпирофосфат синтетазы
2.3.3. Измерение активности глкжозо-6-фосфат дегидрогеназы
2.3.4. Измерение активности сукцинат дегидрогеназы
2.3.5 Измерение скорости поглощения [14С]-рибозы
клетками E
2.3.6. Определение содержания белка
2.3.7. Определение содержания родопсина
2.3.8. Определение содержания неорганического фосфата
2.3.9. Определение содержания пирофосфата
2.3.10. Электрофорез в ПААГ
2.4. Генетические и молекулярно-биологические
методы исследований
2.4.1. Культивирование клеток
2.4.2. Выделение ДНК плазмид из клеток E
2.4.3. Получение компетентных клеток
2.4.4. Трансформация
2.4.5. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами, электрофорез ДНК в агарозном геле, элюция ДНК из гелей
2.4.6. Мутагенез Н-метил-К’-нитрочМ-нитрозогуанилином
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Изучение особенностей биосинтеза пуринов в сетчатке млекопитающих
3.1.1. Изучение цикличности процесса биосинтеза пуринов в сетчатке крыс
3.1.2. Очистка и характеристика амидофосфорибозилтрансферазы
из сетчатки быка
3.1.3. Очистка и характеристика фосфорибозилпирофосфат-синтетазы из сетчатки быка
3.1.4. Изучение распределения ферментов биосинтеза пуринов
в различных субклеточных фракциях сетчатки быка
3.2. Изучение роли рибозо-5-фосфата в регуляции биосинтеза пуринов
de novo у E
3.2.1. Конструкция использованных в работе плазмид
3.2.2. Изучение влияния содержания RbsD белка в клетке на рост штаммов
3.2.3. Роль рибозо-5-фосфата в ингибировании роста клеток
в присутствии избыточного количества RbsD белка
3.2.4. Влияние RbsD белка на образование фосфорибозилпирофосфата

3.2.5. Измерение активности фосфорибозилпирофосфат-синтетазы в клетках, содержащих избыточное количество RbsD белка
3.2.6. Влияние RbsD белка на биосинтез пуринов de novo
3.2.7. Измерение активности амидофосфорибозилтрансферазы в клетках, содержащих избыточное количество RbsD белка
3.2.8. Изучение внутриклетояной локализации RbsD белка
Глава 4. Обсуждение результатов
Выводы
Список цитируемой литературы
ФРА - продукта реакции, катализируемой АФТФ. По-видимому, это уменьшение обеспечивается частично благодаря ингибированию фермента конечными продуктами биосинтеза (Henderson, 1962), частично за счет уменьшения внутриклеточной концентрации ФРПФ - необходимого предшественника биосинтеза. Во-вторых, доказательством роли АФТФ в регуляции скорости биосинтеза пуринов может служить тот факт, что при ингибировании биосинтеза в присутствии экзогенных пуринов в клетках не происходит накопления промежуточных продуктов биосинтеза (Wyngaarden etal., 1958). В-третьих, в быстро делящихся клетках наблюдается повышенная активность этого фермента (Katunuma, Weber, 1974).
Активность АФТФ в клетках может регулироваться на нескольких уровнях, а именно, на уровне изменения активности фермента и на уровне его транскрипции. Инактивация фермента за счет окисления кислородом может, по некоторым данным, приводить не только к его ингибированию, но также к деградации (Switzer, 1979). Таким образом, этот путь регуляции может действовать на обоих уровнях.
Как уже упоминалось выше, фермент аллостерически регулируется конечными продуктами биосинтеза, а также внутриклеточной концентрацией ФРПФ. Результаты экспериментов, проведенных с ферментом, очищенным из плаценты человека, привели к созданию модели, согласно которой активность фермента и процесса биосинтеза в целом определяется относительным распределением в клетке между его активной и неактивной формами (Holmes etal., 1973, б). Имеются данные, подтверждающие, что эта модель справедлива in vivo. Так, например, содержание пуриновых нуклеотидов в печени мышей понижается на 35 % после внутривенного введения фруктозы. Помимо уменьшения содержания пуриновых нуклеотидов, наблюдается также 2-3 -кратное увеличение концентрации ФРПФ. При этом если до введения фруктозы
4,5 % АФТФ находилось в активной мономерной форме, то после инъекции -33,4% (ItakuraM. etal., 1979). Еще одним свидетельством роли ФРПФ в регуляции скорости биосинтеза пуринов, может быть то, что у людей, имеющих гиперактивную ФРПФ-синтетазу, наблюдается существенная сверх-продукция пуринов. Клетки таких пациентов в культуре демонстрируют увеличенную концентрацию ФРПФ и повышенную скорость образования ФРА (Becker, 1978). Таким образом, считается, что регуляция содержания ФРПФ в клетке является