Структурная организация изоформ малатдегидрогеназы и их функциональная роль в адаптивной реакции бактерий Sphaerotilus Natans

• Автор: Арабцева, Мария Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 142 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физиологобиохимические характеристики бактерий рода

1.1.1. Экологоморфологические характеристики бактерий

1.1.2. Характеристика па

1.2. Физикохимические и кинетические свойства малатдсгидрогеназы

1.2.1. Способы получение высокоочищенных препаратов

1.2.2. Общая характеристика каталитического действия

1.2.3. Кинетические параметры

1.2.4. Влияние концентрации ионов водорода

1.2.5. Влияние интермедиатов и ионов
1.2.6. Влияние температуры на активность МДГ
1.2.6.1. Температурный оптимум
1.2.6.2. Термостабильность МДГ
1.3. Атомносиловая микроскопия
1.3.1. Исследование биообъектов и макромолекул
1.3.2. Основной принцип работы атомносилового микроскопа и режимы сканирования
1.4. Молекулярная абсорбционная спектроскопия электронных переходов
1.4.1. Спектральные характеристики ароматических аминокислот в УФобласти
1.4.2. Аминокислотный состав малатдегидрогеназы
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Объект и методы исследования
2.1.1. Объект исследования
2.1.2. Методы исследования
2.1.2.1. Состав питательной среды для культивирования
2.1.2.2. Определение активности фермента
2.1.2.3. Определение общего количества белка
2.1.2.4. Выделение и очистка малатдегидрогеназы
2.1.2.5. Электрофоретические исследования
2.1.2.5.1. Аналитический электрофорез
2.1.2.5.2. Определение гомогенности ферментативных препаратов
2.1.2.5.3.Специфическое проявление МДГ
2.1.2.5.4.Определение молекулярной массы субъединиц
2.1.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента
2.1.2.7. Ингибиторный анализ
2.1.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляция
активности малатдегидрогеназы
2.1.2.9. Определение структурных особенностей МДГ методом атомносиловой микроскопии
2.1.2 Регистрация спектров поглощения ароматических аминокислот малатдегидрогеназы
2.1.3. Статистическая обработка экспериментальных данных
2.2. Полученные результаты и их обсуждение
2.2.1. Исследование изоферментного состава малатдегидрогеназы у бактерий БрЬаегоШш пМат
2.2.2. Очистка малатдегидрогеназы из исследуемых бактерий
2.2.3. Определение гомогенности ферментных препаратов
2.2.4. Четвертичная структура МДГ из изучаемых бактерий
2.2.4.1. Определение молекулярной массы нативного фермента
2.2.4.2. Определение субъединичного строения МДГ
2.2.5. Кинетические и регуляторные характеристики малатдегидрогеназы
2.2.5.1. Влияние концентрации ионов водорода
2.2.5.2. Определение константы Михаэлиса
2.2.5.3. Определение константы субстратного ингибирования
2.2.5.4. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность МДГ
2.2.5.5. Влияние температуры
2.2.5.5.1 .Температурный оптимум
2.2.5.5.2.Термостабильность МДГ
2.2.6. Влияние ротенона и итаконата на соотношение димерной и тетрамерной форм МДГ
2.2.7. Топография поверхности молекулы фермента
2.2.8. Сравнительный анализ спектров поглощения МДГ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Путинских конференциях молодых учных Биология наука ого века Пущино, , на второй международной конференции Проблемы биоэкологии и пути их решения Саранск, ежегодной научной сессии отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета . Публикации Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 9 публикациях 6 статьях и 3 тезисах. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 2 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы 7 источников. Иллюстрационный материал включает рисунка и таблиц. ГЛАВА 1. Бактерии размножаются внутри чехла поперечным делением и могут покинуть его в виде подвижных клеток. Нити способны прикрепляться к стенкам сосуда, погруженным растениям, камням и другим поверхностям 0. Ветвление филаментов отсутствует. Другие источники показывают наличие ветвлений, особенно в конце логфазы роста 7. Одиночные или сдвоенные клетки гонидии отделяются от чехла и передвигаются при помощи пучка монополярных жгутиков. Чехлы обычно тонкие без включений оксидов железа и марганца. Они не всегда могут быть идентифицированы, когда полностью заполнены клетками, однако если часть чехла свободна от клеток, идентификация организма значительно упрощается рис. Поверхность чехлов нагань имеет гладкую структуру. Снаружи чехол покрыт слоем слизи различной толщины. Размер и форма колоний у данных бактерий зависит от способности того или иного штамма к формированию чехла. Обычно колонии неправильной формы. Часто колонии характеризуются гладкой, плотной центральной частью и взъерошенной периферийной . Па поверхности жидкой среды организмы часто образуют пленку, которая формируется из длинных неветвящихся филаментов, заключенных в оболочку. ГЛАВА 1. Бактерии рода БрНаегоЕкм это одноклеточные грамотридательиые организмы размером 1,22,5 х 2 мкм. Представляют собой длинные нити, которые состоят из клеток, удерживаемых тонким чехлом. Бактерии размножаются внутри чехла поперечным делением и могут покинуть его в виде подвижных клеток. Нити способны прикрепляться к стенкам сосуда, погруженным растениям, камням и другим поверхностям 0. Ветвление филаментов отсутствует. Другие источники показывают наличие ветвлений, особенно в конце логфазы роста 7. Одиночные или сдвоенные клетки гонидии отделяются от чехла и передвигаются при помощи пучка монополярных жгутиков. Чехлы обычно тонкие без включений оксидов железа и марганца. Они не всегда могут быть идентифицированы, когда полностью заполнены клетками, однако если часть чехла свободна от клеток, идентификация организма значительно упрощается рис. Поверхность чехлов Снаружи чехол покрыт слоем слизи различной толщины. Размер и форма колонии у данных бактерий зависит от способности того или иного штамма к формированию чехла. Обычно колонии неправильной формы. Часто колонии характеризуются гладкой, плотной центральной частью и взъерошенной периферийной . Па поверхности жидкой среды организмы часто образуют пленку, которая формируется из длинных неветвящихся филаментов, заключнных в оболочку. Рис. Длинные неветвящиеся и покрытые оболочкой нити 5. При помощи экстрагирования и калориметрирования в чехлах бактерий рода БрНаегоШш были обнаружены углеводы ,1 , белки ,2 , липиды 13 , 6. С использованием газожидкостной хроматографии было показано присутствие глюкозы и галактозы в молярном соотношении 14. Основные аминокислоты, присутствующие в чехле глицин ,2 мол. Чехлы устойчивы к агентам, восстанавливающим дисульфидные связи дитиотрейтол и 2меркаптоэтанол и к обработке протеазами. Чехлы также содержат гетерополисахариды, формирующиеся из глюкозы и галактозамина. Для БрНаегош характерен строго дыхательный тип метаболизма с кислородом в качестве терминального акцептора электронов. Эти микроорганизмы способны расти при очень низких концентрациях растворенного кислорода меньше 0,1 мгл в диапазоне температур от до С температурный оптимум С при 6,57,5.