Структурно-функциональные особенности белковых комплексов митохондриальных контактных сайтов

• Автор: Высоких, Михаил Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гексокиназа
1.1. Гексокиназная реакция и ее роль в клеточном метаболизме
1.2.Изозимы гексокиназы тканей млекопитающих
1.3. Внутриклеточная локализация гексокиназы
1.4. Связывание гексокиназы с порином
1.5. Особенности изучения адсорбционного поведения гексокиназы
2. Митохондриальный порин
2.1. Идентификация порина как белка потенциал-зависимого комплекса
2.2. Выделение, очистка и состав митохондриального порина
2.3. Методы функциональной реконструкции и изучения активности митохондриального порина
2.4. Диаметр водной поры, потенциал-зависимость проводимости и ионная селективность поринового канала
2.4.1. Диаметр водной поры
2.4.2. Механизм потенциал-зависимости и селективный фильтр
поринового канала
2.5. Порин-ферментные комплексы
2.6. Биогенез и строение митохондриального порина
2.7. Порин и митохондриальный бензодиазепиновый рецептор
2.8. Проблемы, возникающие при исследовании митохондриального порина
3. Транслокатор адениновых нуклеотидов
3.1. Локализация и свойства АНТ
3.2. Цикл переноса нуклеотидов
3.3. Регуляция переноса нуклеотидов мембранным потенциалом
3.4. Модели, описывающие механизм трансмембранного переноса
3.5. Ингибиторы переноса нуклеотидов транслокатором
3.6. Структура транслокатора адениновых нуклеотидов
4.Креатинкиназ а
Материалы и методы.
1. Выделение митохондрий
2. Исследование функционального состояния митохондрий
3. Определение концентрации белка
4. Определение энзиматической активности
5. Выделение порина методом одноступенчатой адсорбционной хроматографии
6. Очистка белковых комплексов митохондриальных контактных сайтов и исследование кинетического поведения гексокиназы и креатинкиназы в составе комплексов
7. Исследование канальной активности порина в составе выделенных комплексов и для индивидуального белка
8. Разделение белковых комплексов контактных сайтов методом ионообменной хроматографии
9. Получение поликлональных антител на атрактилозид-связывающий участок транслокатора
10. Очистка транслокатора контактных сайтов методом хроматографии
на иммуносорбенте
11. Определение молекулярного веса выделенных белковых комплексов контактных сайтов
12. Идентификация компонентов выделенных белковых комплексов контактных сайтов
13. Определение М-концевой последовательности транслокатора, выделенного методом иммуносорбции из различных комплексов с креатинкиназой
14. Фракционирование мембран митохондрий почек крысы и очистка креатинкиназы из различных компартментов митохондрии
15. Определение стехиометрии комплексов периферических киназ и мембранных белков митохондрии для различных комплексов из
разных тканей
16. Определение содержания липидов в составе исследуемых белковых комплексов
17. Применение сшивающих реагентов для выделения комплексов
периферических киназ и мембранных белков митохондрии
18. Изоэнзимэлектрофорез креатинкиназы в полученных пробах

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
1.Фракционирование митохондрий почек и исследование распределения активности креатинкиназы в различных компартментах
2. Очистка креатинкиназы методом анионообменной хроматографии
3. Исследование белкового состава фракций элюата с ДЕАЕ целлюлозы, обладающих активностью креатинкиназы
4. Исследование липидного состава фракций с ДЕАЕ цллюлозы, содержащих креатинкиназу и мембранные белки
5. Фракционирование креатинкиназы митохондрий мозга на ДЕАЕ целлюлозе
6. Определение относительной молекулярной массы предполагаемых комплексов креатинкиназы и мембранных белков
7. Идентификация изоформ транслокатора в составе исследуемых белковых ассоциатов
8. Использование сшивающего реагента при получении исследуемых препаратов креатинкиназы митохондрий мозга
9. Определение стехиометрии компонентов фракционируемых комплексов
10. Определение стехиометрии липидов в составе исследуемых
комплексов
11. Выделение и анализ комплексов методом электрофореза в нативных условиях и в присутствии додеци л сульфата натрия
12. Определение кинетических параметров гексокиназной реакции в составе комплекса фермента с митохондриальными мембранными белками
13. Канальная активность порина в составе белкового комплекса
с гексокиназой
14. Изозим-специфическое распределение АТФ/АДФ антипортера в митохондриях
мозга и почек в составе комплексов с креатинкиназой и гексокиназой
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

достаточно для их работы в течение нескольких секунд (Infante and Davies, 1965). Однако в клетках эта проблема практически отсутствует, поскольку креатинкиназа рефосфорилирует АДФ за счет пула фосфокреатина со скоростью, в 15-20 раз превышающей синтез АТФ митохондриями (окислительное фосфорилирование) и гликолитическим путем и почти в 100 раз - синтез АТФ de novo (Ingwall et a!., 1990). Кроме того, помимо поддержки постоянного уровня АТФ, креатинкиназа в клетке также выполняет и функцию сенсора, в микромолярном ранге определяющего и регулирующего уровень АДФ (Км по АДФ варьирует для разных организмов и тканей от 10 до 40 мкМ (Levin et al., 1990). Известно, что уровень АДФ в цитоплазме является одним из основных параметров, регулирующих скорость окислителтного фосфорилирования митохондрий. Определенный методом 31Р - протонного магнитного резонанса уровень свободного АДФ в цитозоле неработающей мышцы находится в ранге 1-20 мкМ, измерения при помощи равновесной кинетики дают значение 37 мкМ (Lawson and Veech, 1979) в то время как определение концентрации суммарного АДФ химическими методами дает величину 100-500 мкМ. В лаборатории Чанса было показано (Chance et al., 1986), что в скелетной мышце АДФ связан преимущественно с F-актином и недоступен для креатинкиназы. В то же время, при наличии мышечной активности, существенно снижается концентрация фосфокреатина, происходит накопление неорганического фосфата, а концентрация свободного АДФ непропорционально вырастает лишь до 100-500 мкМ. Объяснение этому феномену было найдено сравнительно недавно. В ряде работ было показана локализация креатинкиназы в М-полосе скелетной мышцы (Turner et al., 1973; Wallimann et al., 1977), (Levitsky et al., 1978) и предложена модель челночного переноса фосфорила с АТФ, синтезированного митохондриями, через фосфокреатин и креатинкиназу на АДФ в миофибриллах (Levitsky et al., 1978). В ряде работ Бессмана и сотрудников (Bessman and Geiger, 1981) (Bessman and Carpenter, 1985) с радиоактивно мечеными нуклеотидами предложенная модель получила экспериментальное подтверждение. Дальнейшее развитие модели было достигнуто после определения коэффициентов диффузии в клетке для свободного АДФ, АТФ, фосфокреатина и креатина (Yoshizaki et al., 1990). Методом неинвазивного 31Р - протонного магнитного резонанса были получены следующие величины - 57 мкм для фосфокреатина и 37 мкм для креатина, 1,8 мкм для АДФ и 22 мкм для АТФ. Столь резкое различие, наблюдаемое для АДФ и фосфокреатина, свидетельствует о том, что диффузия нуклеотидов (особенно