Совместное участие рецептора церулоплазмина и медьтранспортной АТРазы, продукта гена болезни Менкеса, в связывании церулоплазмина

• Автор: Платонова, Наталья Андреевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 134 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение
Часть 1. Обзор литературы
1.1. Биологическая роль меди
1.1.1. Роль ионов меди в клеточных процессах
1.1.2. Содержание и распределение меди в организме человека
1.1.3. Нарушения метаболизма меди
1.2. Метаболическая система меди (МСМ)
1.2.1. МСМ прокариотов
1.2.2. МСМ дрожжей
1.2.3. МСМ человека
1.2.3.1. Церулоплазмин (ЦП)
1.2.3.1.1. Строение ЦП
1.2.3.1.2. Структура гена ЦП и его экспрессия
1.2.3.1.3. Биосинтез и посттрансляционное созревание ЦП
1.2.3.1.4. Тканеспецифические молекулярные формы ЦП. Активность гена 28 ЦП в течение онтогенеза
1.2.3.1.5. Функции ЦП
1.2.З.2. Мембранные белки
1.2.З.2.1. Мембранные насосы
1.2.3.2.2. Трансмембранные рецепторы
1.2.З.З. Цитозольные медьтранспортные белки
1.2.3.4. Транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов МСМ
1.3. Сходство мембранных белков МСМ различных видов
Часть 2. Материалы и методы
2.1. Материалы, использованные в работе
2.2. Методы исследования
2.2.1. Препараты белков и пептидов
2.2.1.1. Выделение рецептора ЦП и получение антител к нему
2.2.1.2. Синтез пептидов А1р7а и их конъюгация с белком
2.2.1.3. Связывание ЦП с пептидами и обработка комплекса системой окисления, катализируемой металлом (СОКМ)
2.2.1.4. Иммобилизация пептида Р16 на монолитный макропористый диск
2.2.1.5. Аффинная мембранная хроматография ЦП с Р16, иммобилизованным на монолитный макропористый диск
2.2.2. Клонирование кДНК рецептора ЦП
2.2.2.1. Иммунологический скрининг экспрессионной библиотеки кДНК 57 плаценты человека в векторе >.$
2.2.2.2. Выделение ДНК фага 1
2.2.2.З. Выделение плазмидной ДНК
2.2.2.4. Субклонирование фрагмента кДНК рецептор ЦП в плазмидном векторе рТ219
2.2.2.S. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля
2.2.2.6. Выделение полирибоеомной РНК
2.22.1. Получение [32Р]ДНК-зондов
2.2.2.8. Перенос РНК и ДНК на нитроцеллюлозные фильтры
22.2.9. Блот-гибридизация [32Р]ДНК-зонда с РНК или ДНК
2.3. Аналитические методы
2.3.1. Анализ белков
2.3.1.1. Секвенирование пептидов
2.3.2. Анализ нуклеиновых кислот
2.З.2.1. Электрофоретический анализ
2.3.2.2. Рестрикционный анализ ДНК
2.3.2.3. Спектрофотометрическое определение концентрации нуклеиновых кислот
2.3.2.4. ПЦР ДНК фага Xgtll
2.3.2.5. Секвенирование кДНК рецептора ЦП
2.3.3. Измерение концентрации меди
Часть 3. Результаты и обсуждение
3.1. Выделение кДНК рецептора ЦП и ее частичная характеристика
3.1.1. Выделение рецептора ЦП из мембран эритроцитов человека и характеристика антител к рецептору ЦП
3.1.2. Скрининг экспрессионной кДНК библиотеки плаценты человека
3.1.3. Анализ изолированного клона
3.1.4. Изучение профиля тканеспецифической экспрессии гена рецептора ЦП
3.1.5. Анализ последовательности вставки кДНК рецептора ЦІІ
3.1.6. Общая характеристика рецептора ЦП
3.2. Изучение взаимодействия ЦП с фрагментами Atp7a
3.2.1. Выбор участков Atp7a для изучения связывания с ЦП
3.2.2. Тестирование пептидов Р16 и Р15 на способность связывания с ЦП методом белкового фут-принтинга
3.2.3. Кинетическая характеристика взаимодействия ЦП с Р16
3.2.4. Изучение действия обработки Хелекс-100 на атомы меди в комплексах Р15-ЦП и Р16-ЦП
3.2.5. Встречаемость Р15 и Р16 в Р1-АТРазах разных организмов
3.2.6. Выявление структурного сходства между рецептором ЦП, ЦП и А1р7а
3.4. Заключение
Выводы
Список цитируемой литературы
Список сокращений, встречающихся в тексте
АТР7А, Atp7a - ген АТРазы Менкеса и его бежовый продукт, соответственно
АТР7В, Atp7b - ген АТРазы Вильсона и его белковый продукт, соответственно
ГМА-ЭДМА - глицидилметакрилат, сшитый этилендиметакрилатом
ЖКТ желудочно-кишечный тракт
МИТФ медь-индуцибельные транскрипционные факторы
МСМ метаболическая система меди
ОФ ВЭЖХ обращенно-фазовая высоко-эффективная жидкостная хроматография
IIAA Г полиакриламидный гель
прсРНК полирибосомная РНК
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полиэтиленгликоль
СОКМ система окисления, катализируемая металлом
ТХУ трихлоруксусная кислота
цнс центральная нервная система
ЦП церулоплазмин
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
а.о. аминокислотный остаток
мол. масса молекулярная масса
Atxl, Lys7, Сох17 цитоплазматические шапероны меди дрожжей
BSA бычий сывороточный альбумин
Ссс2 медьтранспортная Р1-АТРаза дрожжей
Ctrl транспортер ионов меди в дрожжах
DTT дитиотреитол
Fet3 трансмембранная мультимедная ферроксидаза дрожжей
Ftrl транспортер ионов железа в дрожжах
Heph (гефестин)- мембранный ЦП-подобный транспортер ионов железа слизистой ЖКТ мышей
IPTG изопропил Р - Б-тиоі алактопиранозид
pCpRl плазмида рТ219, содержащая фрагмент кДНК рецептора ЦП длиной 2.3 т.п.н.
SDS додецилсульфат натрия

может варьироваться от одной - у паразитических бактерий, до 16 - у дрожжей и больше 30 - у растений и животных.
Р-АТРазы классифицируют в зависимости от типа транспортируемого металла [109]. К субсемейству Р1-АТРаз относится Р-АТРазы, транспортирующие тяжелые металлы. Это, например, CuI+-ATPin».i и ( <174-АТРазы высших и низших эукариот, цианобактерий и эубактсрий. 14-ЛТРазы содержат все домены, свойственные Р-АТРазам и имеют 6-8 трансмсмбрянных сегментов. Последние 4 трансмембранных домена, возможно, могут образовывать ионный канал.
Наиболее характерными признаками Р1-ЛТРаз является наличие от 1 до 6 металлсвязывающих мотива с GMTCXXC последовательностью на N-конце молекулы, СРС- и SEHPL-мотивов, вовлеченных в транслокацию металла через мембрану (см. схему 1.4).
У человека обнаружены две Р1-АТРазы, которые имеют очень высокую степень гомологии. Гены этих белков локализованы на разных хромосомах, в течение онтогенеза их активность и место экспрессии изменяется. Мутации этих очень сходных белков приводят к формированию противоположных фенотипов: болезни Менкеса и болезни Вильсона.
проявляющееся в виде патологии ЦНС и разрушения соединительной ткани [114]. Оно имеет в основе во врожденный дефект метаболизма меди, который выражается в дефиците сывороточной меди и медьсодержащих ферментов, развивающемся еще в эмбриональном развитии. Болезнь встречается с частотой 1 на 200000 новорожденных [74]. Так как новорожденные с болезнью Менкеса погибают в течение первых недель жизни, то всесторонние исследования метаболизма меди проводились на гемизиготных носителях гена болезни Менкеса и в культивируемых клетках, первично полученных от этих больных. Они дали различные сведения о распределении меди в органах, содержании и активности медьсодержащих белков.
Молекулярный дефект, вызывающий болезнь Менкеса, был установлен в 1993 г. одновременно 3-мя лабораториями в США в Канаде и в Австралии [47,
и Болезнь Менкеса - Х-связаннос рецессивное заболевание,