Структурно-функциональное картирование белков цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем

• Автор: Колесанова, Екатерина Федоровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 377 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Введение
2. Обзор литературы
2Л. Поверхность белковых молекул и ее свойства
2.2. Антигенные свойства белков и условия их реализации
2.2.1. Общая характеристика В-эпитопов. или антигенных детерминант
2.2.1.1. Классификация В-эпитопов
2.2.1.2. Особенности структуры и физико-химические свойства В-эпитопов
2.2.2. Т-эпитопы
2.2.3. Молекулярные основы иммунологического распознавания
2.2.3.1.Структура антигенсвязывающих участков (паратопов) антител
2.2.3.2. Репертуар антигенсвязывающих участков антител
2.2.3.3. Кинетические и термодинамические характеристики взаимодействия белковых и пептидных антигенов с антителами
2.2.3.4. Основные структурные характеристики комплексов антиген-антитело
2.2.3.5. Механизм взаимодействия антигена с антителом
2.2.4. Механизм формирования антителозависимого иммунного ответа
2.2.4.1.Селекция лимфоцитов
2.2.4.2. Превращение В-лимфоцитов в плазматические клетки
2.2.4.3. Структурно-функциональная взаимозависимость В- и Т-эпитопов. Явление иммунодоминантности
2.2.4.4. Роль адъюванта в формировании иммунного ответа
2.2.5. Практическое использование сведений о структуре В-эпитопов белков
2.3. Структура и свойства поверхностей межбелковых контактов
2.4. Методы картирования участков белок-белкового узнавания
2.4.1. Прямое исследование структуры белковых комплексов
2.4.2. Расчетные методы (молекулярное моделирование и предсказание)
2.4.3. Экспериментальные методы картирования участков белок-белкового узнавания
2.4.3.1. Использование мутантных белков
2.4.3.2. Метод химических модификаций
2.4.3.3. Метод ограниченного протеолиза с последующим масс-спектрометрическим анализом

2.4.3.4. Обмен атомов водорода
2.4.3.5. Использование экспрессионных библиотек
2.4.3.6. Метод пептидного сканирования
2.4.3.7. Использование фаговых и синтетических пептидных библиотек случайного состава
2.4.3.В. Использование антипептидных антител
2.5. Общая характеристика монооксигеназных систем и их компонентов
2.5.1. Состав и функции монооксигеназной системы
2.5.2. Цитохромы Р450
2.5.2.1.Надсемейство цитохромов Р450
2.5.2.2. Структурно-функциональные исследования цитохромов Р450
2.5.2.3. Каталитический цикл цитохромов Р450
2.5.2.4. Конформационные изменения в молекулах цитохромов Р450,
денатурация и рефолдинг
2.5.2.5. Цитохром Р450 101
2.5.2.6. Цитохромы Р450 эндоплазматического ретикулума (микросомальные)
2.5.3. Иммунологические исследования цитохромов Р450
2.5.4. Белок-белковые взаимодействия в монооксигеназных системах
2.5.4.1. МОС бактерии Pseudomonasputida
2.5.4.2. МОС эндоплазматического ретикулума
2.5.4.3. Молекулярные механизмы взаимодействия компонентов МОС
эндоплазматического ретикулума
3. Материалы и методы
3.1. Матери алы
3.1.1. Реагенты для синтеза пептидов
3.1.2. Растворители
3.1.3. Препараты белков 13
3.1.4. Среды и расходные материалы для хроматографии, обессоливания и иммунодиффузии
3.1.5. Прочие реактивы
3.1.6. Расходные материалы для синтеза пептидов и ELISA
3.2. Оборудование
3.3. Методы

3.3.1. Параллельный синтез неотщепляемых пептидов на иглах
3.3.2. Аминокислотный анализ пептидов, синтезированных на иглах
3.3.3. Получение препаратов ano-CYPl01 и-СYP2B4
3.3.4. Иммунизация животных и получение антисывороток
3.3.5. Получение препаратов IgG и IgY
3.3.6. Определение титра антител против белков с помощью
иммуноферментного сорбционного анализа (ELISA)
3.3.7. Тестирование антисыворотки к цитохромам Р450 1А2 и 2В4 методом двойной иммунодиффузии по Ухтерлони
3.3.8. Иммуноферментный сорбционный анализ (ELISA) пептидов на иглах
3.3.9. Выявление пептидных фрагментов, ответственных за взаимодействие с белками - компонентами монооксигеназных систем
3.4. Статистическая обработка результатов
3.4.1. Обработка результатов EL1SA
3.4.2. Статистический анализ эффективности предсказательных методов
3.5. Программное обеспечение
4. Результаты и их обсуждение
4.1. Синтез пептидов на иглах и их характеристика
4.1.1. Синтез пептидов на иглах
4.1.2. Контроль качества синтезированных пептидов
4.2. Антигенное картирование цитохрома Р450 101
4.2.1. Антигенная карта холо-Р45 0 101
4.2.2. Соотношение антигенной карты холо-цитохрома Р450 101 и пространственной структуры молекулы
4.2.3. Антигенная карта апо-цитохрома Р450 101
4.2.4. Сравнение суммарных антигенных карт холо- и ano-CYPlOl
4.2.5. Роль отдельных аминокислотных остатков иммунодоминантного линейного эпитопа цитохрома Р450 101 312LKKGDQ317 в распознавании специфическими антителами
4.2.6. Обобщение результатов антигенного картирования цитохрома Р450 101
4.3. Антигенное картирование коротких электронпереносягцих белков - редокс-партнеров цитохромов Р450
4.3.1. Антигенное картирование цитозольного домена цитохрома Ь5

Помимо аффинности, или сродства, антитела к антигену, представляющую собой фактически характеристику паратопа антитела, используется термин «авидность», характеризующий взаимодействие целого антитела с антигеном. Под авидностью антитела понимают суммарную эффективность взаимодействия всех связывающих участков целой молекулы антитела с мультивалентным антигеном. Авидность антитела зависит не только от его аффинности, она пропорциональна также числу антигенсвязывающих участков на молекуле антитела. Авидность IgM с 10 паратопами намного превышает авидность IgG той же аффинности, имеющего только два антигенсвязывающих участка. При связывании антитела с обособленной -антигенной детерминантой (например, с эпитопом, прикрепленном к твердой фазе), по определению являющейся моновалентной, экспериментально наблюдаемая авидность для антитела может быть меньшей, а аффинность - такой же, как при связывании с нативным белком. Однако при высокой плотности синтетических пептидов на твердофазном носителе их совокупность можно рассматривать как мультивалентный антиген, и в этом случае речь будет идти об определении скорее авидности. чем аффинности, антител при взаимодействии последних с таким пептидным препаратом. Иногда вводится понятие «авидности антисыворотки», включающее в себя совокупность признаков, отвечающих за связывание, то есть как аффинности антигенсвязывающего участка, так и авидности антител, содержащихся в этой сыворотке. В иммунологических экспериментах мерой авидности антисыворотки по отношению к определенному антигену является ее титр, то есть максимальная величина разведения сыворотки, при которой еще достоверно регистрируется связывание антигена с антителами тем или иным методом иммуноанализа (Чард, 1981). Поскольку чувствительности разных методов иммуноанализа сильно различаются, титры одной и той же антисыворотки, определенные разными методами, могут отличаться в сотни и тысячи раз. Поэтому при обозначении величины титра антисыворотки должен указываться использованный метод иммуноанализа. В настоящее время наиболее распространенными методами определения титров антисывороток и в клинике, и в научно-исследовательской работе являются радиоиммуноанализ (Чард. 1981) и разновидности иммуноферментного- анализа -иммуноферментный сорбционный анализ (Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), иммуноблот- и иммунодот-анализы (Groome, 1994).