Структурно-функциональные особенности алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Pichia metahanolica

• Автор: Ашин, Виктор Васильевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 83 с.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Функциональная роль и процессинг алкогольоксидазы
1.1.1. Участие алкогольоксидазы в первичном метаболизме дрожжей
1.1.2. Регуляция и структураТОХгенов
1.1.3. Транспорт алкогольоксидазы в пероксисомы
1.1.4. Сборка алкогольоксидазы.«
1.1.5. Регуляция биосинтеза ФАД - кофактора алкогольоксидазы
1.2. Свойства алкогольоксидазы
1.2.1. Биохимическая характеристика
1.2.2. Олигомерные формы алкогольоксидазы
1.2.3. Механизм катализа
1.2.4. Взаимодействие с азидом натрия
1.2.5. Взаимодействие с перекисью водорода и формальдегидом
1.2.6. Полухинон ФАД в активном центре алкогольоксидазы
1.3. Модифицированный ФАД - уникальный кофактор алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей
1.3.1. Модификация ФАД
1.3.2. Структура мФАД
1.3.3. Зависимость Km и Vmax алкогольоксидазы от содержания
модифицированного ФАД
1.4. Алкогольоксидаза в биотехнологии
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Штаммы дрожжей и условия культивирования
2.2. Индукция изоформ алкогольоксидазы
2.3. Индукция метанолом дрожжей, дефектных по алкогольоксидазе
2.4. Очистка изоформ алкогольоксидазы и минорного белка с активностью алкогольоксидазы
2.4.1. Хроматографические методы
2.4.2. Препаративный электрофорез и проявление алкогольоксидазы
по активности
2.4.3. Электроэлюция из ПААГ алкогольоксидазы и минорного белка с активностью алкогольоксидазы

2.5. Изучение свойств изоформ алкогольоксидазы и минорного белка с активностью алкогольоксидазы
2.5.1. Определение молекулярной массы
2.5.2. Определение кинетических параметров
2.5.3. Определение pH оптимумов активности и стабильности
2.5.4. Хроматофокусирование
2.6. Анализ субъединиц изоформ алкогольоксидазы и минорного белка с активностью алкогольоксидазы
2.6.1. Аминокислотный анализ
2.6.2. ВЭЖХ субъединиц алкогольоксидазы и минорного белка с активностью алкогольоксидазы и их триптических гидролизатов
2.7. Изучение модификации ФАД
2.7.1. Анализ содержания модифицированного ФАД в изоформах алкогольоксидазы и минорного белка с активностью алкогольоксидазы
2.7.2. Эксперименты с алкогольоксидазой в буферных растворах
2.7.3. Эксперименты с ФАД в буферных растворах
2.7.4. Эксперимент с 2 14С-рибофлавином
2.8. Исследование структуры модифицированного ФАД
2.8.1. Препаративное выделение модифицированных ФАД и флавина
2.8.2. Получение масс-спектров модифицированного флавина и рибофлавина
2.8.3. Ограниченная деградация флавинов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
ЗЛ.Очистка и характеристика изоформ алкогольоксидазы
3.1.1. Выделение индивидуальных изоформ алкогольоксидазы
3.1.2. Молекулярные, кинетические свойства изоформ и локализация
3.1.3. Субъединичный состав изоформ.алкогольоксидазы
3.1.4. Экспрессия изоформ алкогольоксидазы и содержание в них
модифицированного ФАД
3.2. Проверка предположения о возможности модификации ФАД
3.2.1. Модификация ФАД в алкогольоксидазе и в клетках дрожжей
3.2.2. Модификация ФАД in vivo с 214С-рибофлавином
3.3. Анализ структуры модифицированного ФАД
3.3.1. Масс-спектрометрический анализ модифицированного флавина

3.3.2. Анализ конфигурации С-атомов углеводного участка модифицированного
флавина
3.4. Очистка и характеристика минорного белка с активностью
алкогольоксидазы
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

3.3.2. Анализ конфигурации С-атомов углеводного участка модифицированного флавина
С целью однозначного определения структуры м-флавина нами впервые проведен анализ углеводного участка данного флавина специально разработанным методом ограниченной деградации и ВЭЖХ. В результате двух последовательных химических реакций, характерных для полиолов (Рис. 16), которыми являются рибофлавин, ФМН и м-флавин, были получены их фрагменты.
^1 т
м сн2он
Н-С-ОН 1Ча.Ю4 Н №ВН4
н-с-он ~ " нч р "
И2 с' СН,ОН
I I

Рис. 16. Схема расщепления диодов N8104 с последующим восстановлением ШВНЦ образующихся альдегидов до спиртов.
Так как структуры рибофлавина и ФМН известны, очевидно, что при селективном и ограниченном расщепленнии их С(ОН)-С(ОН) связей, должны образовываться наборы фрагментов известного строения.
В нашем эксперименте при исчерпывающем расщеплении (Рис. 17) каждого из флавинов образовывался один и тот же фрагмент 3, тогда как в результате ограниченной деградации флавинов появлялся ряд фрагментов, характерных для каждого флавина. Так, из ФМН появлялись два фрагмента, в то время как три фрагмента были получены из рибофлавина или м-флавина. По времени удержания на колонке оба фрагмента ФМН были идентичны фрагментам 2 и 3 рибофлавина и м-флавина, однако фрагмент 1 рибофлавина отличался от фрагмента 1' м-флавина.