Создание с помощью методов генной инженерии штаммов Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris-продуцентов фибробластного интерферона человека, выделение и очистка рекомбинантного белка

• Автор: Парфенова, Любовь Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 161 с. : ил

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.
АГ - аппарат Гольджи
АК - аминокислота
АПК - антигенпрезентирующая клетка
ГДФ - гуанидиндифосфат
ГЭБ - гематоэнцифалический барьер
ИЛ - интерлейкин
ИФН - интерферон
КСФ - колониестимулирующий фактор
КФ - кислая фосфатаза
ОМБ - основной миелиновый белок
ПА - презентация антигена
ПЕП- полная среда без неорганического фосфата
ПЕПФО- полная среда с неорганическим фосфатом
РС - рассеянный склероз
ТсЛ - рецептор Т-лимфоцита
Тх- Т-хелперы
УДФ - уридиндифосфат
ФНО - фактор некроза опухоли
ЭАЭ — экспериментальный аллергический энцефаломиелит ЭР - эндоплазматический ретикулум

ОГЛАВЛЕНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. ЦИТОКИНЫ, ИХ ЗНАЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ.
1.1.Интерфероны: биологическое значение и применение.
1.2.Строение молекулы ß-ИФН.
2.МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ß - ИНТЕРФЕРОНА.
2.1. JAK-STAT путь- главный путь передачи сигнала цитокинов.
2.2. Рецептор ß-ИФН, передача сигнала по JAK-STAT пути.
2.3. Факторы, активируемые ИФН.
3. ПРИМЕНЕНИЕ ß-ИФН В КЛИНИКЕ.
3.1. Механизм действия ß-ИФН при рассеянном склерозе.
3.1.1. Влияние на презентацию антигена :ß-ИФН- иммуномодулятор.
3.1.2. Роль ß-ИФН в развитии иммунного ответа, влияние на продукцию цитокинов различными клетками иммунной системы.
3.1.3. Влияние ß-ИФН на инфильтрацию лимфоцитов ЦНС.
4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ИММУННОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ.
5. РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА КФ2.
5.1. Транскрипционный активатор, кодируемый геном PHQ4.
5.2. Транскрипционный активатор, кодируемый геном PHQ2.
5.3. Белки-регуляторы, кодируемые генами PHQ80 и PHQ85.
5.4. Белок, кодируемый геном PHQ81.
6. СЕКРЕЦИЯ БЕЛКОВ У ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES SEREVISIAE.
6.1. Гликозилирование секреторных белков.

6.2. Роль протеолиза в секреции чужеродных белков.
7. ЭКСПРЕССИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖАХ PICHIA PASTORIS.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. МАТЕРИАЛЫ
1.1. Список сокращений.
1.2. Штаммы.
1.3. Плазмиды.
1.4.Условия культивирования штаммов.
2. МЕТОДЫ.
2.1. Трансформация бактерий E. coli.
2.2 Трансформация дрожжей плазмидной ДНК.
2.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli.
2.4. Методы молекулярного клонирования.
2.5 Электрофорез фрагментов ДНК.
2.6. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.
2.7. Выделение хромосомной ДНК из дрожжей.
2.8. Количественное определение активности кислых фосфатаз.
2.9. Определение концентрации белка.
2.10. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсулъфата натрия.
2.11. Иммуноблотинг.
2.12. Гель-филыпрация на сефакриле S(300) и сефарозе 6В.
2.13. Определение биологической активности ß-ИФН.
2.14. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) молекул ДНК.
2.15. Полимеразная цепная реакция.
2.16. Количественное определение активности ß-галактозидазы

5.1. Транскрипционный активатор, кодируемый геном PHQ4.
Белок Pho4 имеет молекулярную массу 34кДа и состоит из 309 аминокислот (Legrain et al., 1986). В N-концевой области расположен активирующий домен, в центральной части - участки взаимодействия с белком активатором Pho2 и с негативным регулятором Pho80. ДНК-связывающий домен, содержащий спираль-виток-спиральную структуру, находится в С-концевой области (Ogawa et al., 1990). Обнаружена значительная степень гомологии ДНК-связывающих доменов белка Pho4 и транскрипционных факторов млекопитающих (семейство Мус белков, MyoD, El2, Е47), которые связываются с ДНК в виде димера и узнают палиндромную последовательность CANNTG (E-box). Pho4 белок также взаимодействует с промотором гена РН05 в виде гомодимера, в образовании которого участвует цистеин, находящийся в 300 положении (Shao et al., 1998).
Делеционный анализ промотора гена РН05 выявил два сайта связывания белка, кодируемого геном РН04: UAS1 и UAS2 (Bergman, 1986; Vogel et al., 1989). Изучение структуры хроматина промотора гена РН05 показало, что в неактивном состоянии (в условиях репрессии) регуляторная область гена содержит 4 нуклеосомы, которые закрывают UAS2, сайты связывания белка Pho2 и ТАТА бокс. UAS1 находится в коротком гиперчувствительном к действию нуклеаз участке и доступен для связывания белка Pho4 (Svaren et al., 1997). В условиях дерепрессии синтеза КФ2 белок Pho4 транспортируется из цитоплазмы в ядро (O’Neill et al., 1996), связывается с UAS1 при помощи С-концевого кислого домена, при этом активирующий домен белка Pho4 разрушает нуклеосомную структуру промотора гена РН05. После этого происходит взаимодействие белка Pho4 с UAS2, а также белка-активатора Pho2 с собственными сайтами связывания (Svaren et al., 1997).