Нуклеиновые кислоты человеческого молока. Структура и возможные функции

• Автор: Кулигина, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 128 с. : ил.

1 СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Внеклеточные нуклеиновые кислоты: функции в биологических системах и применение в исследовательской и медицинской

практике
1.1. Введение
1.2. Экзогенные нуклеиновые кислоты и их судьба в клетках млекопитающих
1.3. Нуклеиновые кислоты внеклеточных жидкостей
1.3.1. Нуклеиновые кислоты сред культур клеток "| 1.3.2. Нуклеиновые кислоты плазмы крови
| 1.3.3. Нуклеиновые кислоты других физиологических жидкостей
1.4. Биологические эффекты и функции внеклеточных нуклеиновых кислот
1.4.1. Внеклеточные нуклеиновые кислоты как возможные переносчики информации между клетками и органами иммунной системы.
1.4.2. "Неспецифические" эффекты нуклеиновых кислот
1.4.3. Горизонтальный перенос генов
*■ 1.4.4. Биологические эффекты, детерминированные структурой и
последовательностью внеклеточных нуклеиновых кислот
* 1.5. Нуклеиновые кислоты как противоопухолевые вакцины
1.5.1. Дендритные клетки, заполненные РНК
« 1.5.2. РНК-вакцины, основанные на заключении РНК в липосомы (липосомные
РНК-вакцины)

♦* 1.5.3. «Голые» РНК-вакцины
1.5.4. Самореплицирующиеся вакцины
1.5.5. Иммунология РНК вакцин: механизмы и иммуномодуляторы
1.6. Генная терапия
1.6.1. Основные средства доставки генов в организм
1.6.2. Направленная доставка генов
1.6.3. Экспрессия трансфицированных генов
* 1.6.4. О типах клеток - мишеней. Стволовые клетки
1.6.5. Генная терапия рака
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Нуклеиновые кислота плазмы молока человека
3.2. Олигонуклеотиды сыворотки крови
3.3. Олигонуклеотиды спинномозговой жидкости
3.4. Определение состава нуклеиновых кислот человеческого молока
3.5. Количественная оценка содержания РНК в человеческом молоке
3.6. Анализ РНК человеческого молока двумерным электрофорезом в ПААТ
3.7. Выделение индивидуальных олигорибонуклеотидов человеческого молока и установление их первичной структуры
3.7.1. Первичная структура олигорибонуклеотидов 1-3
3.7.2. Первичная структура олигорибонуклеотида 4
3.7.3. Первичная структура олигорибонуклеотида 5
3.8. Механизмы происхождения внеклеточных нуклеиновых кислот в молоке человека
3.9. Биологические эффекты внеклеточных нуклеиновых кислот
3.9.1. Влияние внеклеточных РНК человеческого молока на фосфорилирование молочных белков
3.9.2.Влияние внеклеточных РНК молока на жизнеспособность клеток аденокарциномы молочной железы человека МСР-7
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
C1RHERDSNaAc -ON-PKR -SDS -TEMED -ГАП -ДНК-ДТТ-дцРНК -ЕДТА-киРНК -кнРНК-MTT-мяоРНК-мяРНК -п.о. нт
ПААГПНКРНКРНПрРНКСМЖТрис
тРНК

НКЭФ-

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
4-[(Ы-2-[хлорэтил-Ы-метил)амино]бензиламидная группа
гетерогенные эктопические рибонуклеопротеидные (heterogeneous ectopic RNP-derived structures) ацетат натрия олигонуклеотид
протеинкиназа, активируемая дцРНК додецилсульфат натрия ЫДЬДМ'-тетраметилэтилендиамин гидроксиапатит
дезоксирибонуклеиновая кислота дитиотреитол двуцепочечные РНК этилендиаминтетраацетат короткие интерферирующие РНК короткие некодирующие РНК
3-[4,5-диметилтиазол]-2,5-дифенилтетразолинбромид
малые ядрышковые РНК
малые ядерные РНК
пары оснований
нуклеотиды
полиакриламидный гель полинуклеотидкиназа рибонуклеиновая кислота рибонуклеопротеиды рибосомная РНК спинномозговая жидкость трис-пщроксиметиламинометан транспортная РНК трихлоруксусная кислота нуклеиновая кислота электрофорез
комплексы
содержавшем 8М мочевину, 20 мМ Трис-НС1, pH 7.5, 0.1%-ный бромфеноловый синий и 0.1%-ный ксиленцианол, и разделяли в 20%-ном ПААГ в присутствии 7 М мочевины.
Для выделения полного набора нуклеиновых кислот плазмы молока использовали два подхода:
1. Олигонуклеотиды и нуклеиновые кислоты выделяли из 50 мл свежего молока, взятого у рожениц в первую неделю лактации. Для удаления клеток молоко центрифугировали при 600 g 30 мин на цетрифуге MLW K23D. Для удаления липидов полученную молочную плазму обрабатывали равным объемом охлажденного, насыщенного водой н-бутанола. Гидролиз белков молока проводили 2 ч при 65°С в буфере, содержавшем 0.01 М Трис-НС1, pH 8.0, 5 мМ ЕДТА, 100 мкг/мл протеиназы К
[215]. Гидролизат наносили на колонку с 2 мл Fractogel TSK DEAE-650 (М), промывали 0.15 М NaCl и водой. Олигонуклеотиды элюировали 0.01 М НС1, элюат нейтрализовали 1.5 М Трис-НС1, pH 8.8. Для осаждения нуклеотидного материала к элюату добавляли 10 объемов 2%-ного раствора LiClC>4 в ацетоне. Смесь центрифугировали при 14000 g 15 мин на центрифуге Eppendorf 5415С. Осадок нуклеиновых кислот промывали ацетоном, высушивали и хранили при -20 0 С.
2. К 7 мл свеже-размороженной молочной плазмы добавляли NaCl до конечной концентрации 2 М, ЕДТА до 10 мМ и SDS до 2%-ной концентрации. Для экстракции белков к полученной смеси добавляли равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (10 : 1). Смесь интенсивно встряхивали, центрифугировали (20 мин, 11000 g, Eppendorf 5415С) и отбирали водную фазу. Обработку хлороформом повторяли дважды
[216]. Для осаждения нуклеотидного материала к водной фазе добавляли этанол до 75%-ной концентрации и инкубировали 12 ч при -20 0 С. Смесь центрифугировали при 5000 g 20 мин (центрифуга Eppendorf 5415С). Супернатант удаляли, осадок растворяли в 1 мл буфера, содержавшего 20 мМ NaOAc, pH 4.3, 10 мМ ЕДТА, и повторяли процедуру осаждения нуклеотидного материала этанолом. Осадок высушивали и хранили при -20 0 С.