Новые методы количественного масс-спектрометрического анализа белковых систем с использованием селективных изотопных меток

• Автор: Федяев, Михаил Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. Протеомика задачи и методы.

2.2. Сиквенирование белков и массспектрометрия.

2.2.1. Деградация Эдмана

2.2.2. Бомбардировка быстрыми атомами.

2.2.3. Ионизация в электроспрее.

2.2.4. Ионизация МА1ЛЭ1.

2.2.5. Тандемные массспектрометры

2.2.6. Основы интерпретации тандемных массспектров пептидов

2.2.7. Современные задачи.

2.3. Изотопные метки специфичные к тиольным группам.
2.3.1. Селективная модификация цистеина.
2.3.2. Метки САТ.
2.3.3. Другие метки.
2.4. Изотопные метки специфичные к аминогруппам.
2.4.1. Селективная модификация аминогрупп лизина
2.4.2. Восстановительное димстилирование
2.4.3. Метки Ттщ.
2.4.4. Метод УСАТ.
2.4.5. Другие метки.
3. Экспериментальная часть
3.1. Синтез изотопных реагентов.
3.2. Модификация белков и пептидов изотопными метками
3.3. Гельэлектрофорез
3.4. Хроматомассспектрометричсский анализ
3.5. Биоинформатика.
3.6. Биологические эксперименты.
3.7. Протеомический анализ биологических объектов.
3.8. Биохимические эксперимента.
4. Обсуждение результатов.
4.1. Метод изотопных аналогов с использованием меток специфичных к тиольным группам
4.2. Метод изотопных аналогов с использованием меток специфичных к концевым аминогруппам пептидов
4.3. Биоинформатика.
4.4. Протеомический анализ биологических объектов
5. Выводы
6. Список литературы.
Список использованных


Результатом генной экспрессии является образование белка. Поскольку белки являются основой всех процессов, происходящих в клетках, именно они являются наиболее интересным объектом для изучения. До недавнего времени большая часть работ в протеомике выполнялась с использованием двумерного гельэлектрофореза, однако этот метод показал себя недостаточно эффективным. Объем работ, которые необходимо выполнить в рамках протеомики, требует использования методов и приборов, отличающихся большими производительностями, информативностью и чувствительностью. Таковыми на данный момент являются методы, комбинирующие высокоэффективную жидкостную хроматографию и массспектрометрию. Достижения, сделанные в области массспектрометрии в последние десятилетия, несомненно, являются ключевым моментом в быстром развитии протеомики. Сиквснирование белков и массспектрометрия. Общей задачей массспектральных экспериментов является определение структуры различных молекул путем точного измерения их масс и масс их фрагментов. Первая попытка использования массспектрометрии для определения аминокислотной последовательности пептидов была выполнена в году 3. В своем воплощении она явилась лишь демонстрацией принципиальной возможности определения структуры пептидов с помощью массспекгрометрии наряду с другими биомолекулами, например, алкалоидами, для анализа которых массспектрометрия в то время уже успела себя зарекомендовать. Реализованный метод имел ряд ограничений и, кроме того, был довольно трудоемким включал в себя предварительную модификацию пептидных связей во вторичные амины и карбоксильных групп в силиловые эфиры соответствующих спиртов для увеличения гидрофобности, что позволяло использовать газовую хроматографию и ионизацию электронного удара, которые в то время
составляли основу экспериментальной базы массспектрометрии. Таким образом, предложенный метод не смог составить конкуренцию химическим подходам к определению аминокислотной последовательности, использовавшимся в то время. Деградация Эдмана. П. Эдманом в году была предложена реакция 4, изображенная на Рис. Рис. Реакция Эдмана. Первая стадия взаимодействие фенилизотиоцианата с концевой аминогруппой белка, вторая образование 5тиозолинового производного, превращение в фенилтиогидантоиновое производное соответствующей аминокислоты. Циклическое использование данной реакции позволяет осуществлять последовательное селективное удаление аминокислот с Г4конца белка, а определение удаляемых аминокислот или их производных например, с помощью ВЭЖХ позволяет, соответственно, расшифровать аминокислотную последовательность белка. В появился первый прибор, автоматически выполняющий все стадии данного процесса 5, который получил название сиквенатор. В первой реализации сиквенатора для определения
аминокислот требовалось порядка 0 наномолей белка. Постоянное совершенствование сиквенатора на протяжении тридцати лег привело к появлению приборов, которые способны определить последовательности порядка аминокислот для количеств белка на уровне 1 пикамоль. В то же время метод деградации Эдмана обладает рядом недостатков, наиболее существенными из которых является невозможность сиквснирования белков с блокированной концевой аминогруппой приблизительно всех белков в живой клетке и смесей содержащих 2 и более белков. Бомбардировка быстрыми атомами. С начала х годов постоянно присутствовал интерес к использованию неоспоримых аналитических преимуществ массспектрометрии 6. Однако основным фактором, сдерживающим эти исследования, являлись сложности связанные с отсутствием методов эффективного получения ионов пептидов в газовой фазе. Данные ограничения впервые были преодолены в году 7, 8, когда М. Барбер открыл возможность ионизации сравнительно больших полярных молекул таких как пептиды с помощью бомбардировки быстрыми атомами ББА. В этом методе происходит бомбардировка образца растворенного в вязкой высококипящей жидкости например, глицерин атомами с кинетической энергией в несколько тысяч электронвольт. При этом происходит выброс ионов анализируемого образца в газовую фазу.