Структура лакказы из Coriolus Hirsutus и строение ее активного центра

• Автор: Пегасова, Татьяна Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с.

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
1. Глава 1. Обзор литературы
1.1 История изучения активного центра медьсодержащих оксидаз и их представителя — лакказы
1.2 Подходы к изучению структуры активного центра
1.3 Условия получения кристаллов лакказ из различных источников
1.4 Исследование структур лакказ методом рентгеноструктурного
анализа
Ход полипептидной цепи лакказ
Структура активного центра лакказ на основе данных РСА
Особенности пространственного строения центра Т1
Особенности пространственного строения Т2/ТЗ-кластера
1.5 Механизм действия фермента
Внутримолекулярный перенос электрона
1.6 Заключение
2. Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Материалы и объекты исследования
2.2 Культивирование Согіоїт ЫкиШБ - продуцента лакказы
2.3 Выделение и очистка лакказы
2.3.1 Очистка фермента методом ВЭЖХ
2.3.2 Очистка фермента методом изоэлектрофокусирования
2.3.3 Очистка фермента методом препаративного электрофореза
2.4 Контроль гомогенности препаратов
2.5 Метод определения активности лакказы

2.5.1 Изучение влияния температурно-фазового перехода на каталитическую активность лакказы
2.6 Установление аминокислотной последовательности лакказы из Согіоіив ЫгяШш
2.6.1 Установление аминокислотной последовательности участка 14-конца лакказы С. ЫгяМт
2.6.2 Клонирование и секвенирование кДНК лакказы из С. ЫгзиШй
2.6.2.1 Получение препарата РНК из С. ЫгзиШз
2.6.2.2 Получение препарата кДНК лакказы из С. ЫгБиШв
2.7 Определение степени сходства лакказы из С. ЫпиШя с известными последовательностями лакказ
2.8 СПЕКТРАЛЬНЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ
2.8.1 Регистрация оптических спектров лакказы
2.8.2 Регистрация ЭПР-спектров лакказы
2.9 Измерение малоуглового рентгеновского рассеяния
2.10 Получение кристаллов лакказы
2.11 Сбор диффракционных данных и их обработка
2.12 АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
2.12.1 Определение концентрации белка
2.12.2 Определение количества ионов металлов в белке
2.12.2.1 Масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой
2.12.2.2 Атомно-адсорбционная спектрометрия
2.12.2.3 Спектрофотометрическое определение ионов меди
3. Глава 3. Результаты и их обсуждение
3.1 Очистка, характеристика фермента
3.2 Изучение влияния температурно-фазовых переходов на активность и структуру лакказы из Согіоїт ЫгвШив
3.3 Определение аминокислотной последовательности лакказы из Согіо/т ИгбиШя

3.4 Определение пространственной структуры лакказы методом рентгеноструктурного анализа
3.4.1 Подбор и оптимизация условий кристаллизации лакказы из Согю1ив ЫгвиШв
3.4.2 Рентгеновский эксперимент
3.4.3 Решение пространственной структуры лакказы методом молекулярного замещения
3.4.4 Кристаллическая структура. Уточнение и корректировка модели фермента
3.4.5 Описание вторичной структуры
3.4.6 Пространственная структура активного центра. Координация медных ионов
3.5 Предполагаемый механизм действия фермента
Выводы
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

2.3.1. Очистка фермента методом ВЭЖХ.
После 24 часового диализа против 0.005 М К-фосфатного буфера pH 6.5, препарат обрабатывали ДЕАЕ-целлголозной ватой. Время инкубации с носителем составляло 20 мин. Десорбцию фермента проводили двукратно 0.2 М К-фосфатным буфером, pH 6.5, и диализовали полученный препарат против 0.005 М фосфата pH 6.5. После диализа лакказу наносили на колонку (2 х 20 см) с ДЕАЕ-Тоуореаг1 650 М, уравновешенную 5 мМ фосфатным буфером, pH 6.5. Белок элюировали линейным градиентом ионной силы 2 х 150 мл, создаваемой К-фосфатным буфером pH 6.5, с молярностью от 5 мМ до 200 мМ. Активные фракции объединяли и после диализа против 5 мМ фосфата pH
6.5 рехроматографировали на колонке с ОЕАЕ-Тоуореагі 650 М в тех же условиях, но с более пологим градиентом ионной силы — (2 х 250 мМ). Гомогенный препарат фермента получали методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе БРЬС, используя колонку для гель-фильтрации Супердекс-200. Элюцию проводили 0.05 М КФБ, pH 7.0, со скоростью 1.0 мл/мин.
2.3.2. Очистка фермента методом изоэлектрофокусирования.
Отдиализованный препарат фермента (200 мл) концентрировали
путем ультрафильтрации на волоконной колонке АІІ-0.1 (отсечение до 15 кДа, Кириши, Росссия) до 50 мл с сопутствующим диализом против дистиллированной воды. Изоэлектрофокусирование проводилили в градиенте плотности сахарозы 4% - 40% с использованием РЬаппаІуіе, pH 3.0 - 10.0 на установке той же фирмы. Препарат наносили в 4% сахарозе. Сбор фракций осуществляли с нижней части колонки регулируя скорость перистальтическим насосом (“РЬагтпасіа”, Швеция) и