Рентгеноструктурные исследования флуоресцентных белков из ZOANTHUS

• Автор: Плетнева, Надежда Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 96 с. : ил.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Свойства, структура и применение флуоресцентных белков
1.2. Разнообразие структур хромофоров
1.2.1. Группа хромофоров I (диапазон эмиссии ~445-538 нм)
1.2.2. Группа хромофоров II (диапазон эмиссии ~ 570-655 им)
1.2.3. Группа хромофоров П1 (посттрансляционная фрагментация основной цепи)
1.2.4. Группа хромофоров IV (посттрансляционная модификация первого остатка хромофора)
ГЛАВА 2. КРАСНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, zRFP574 {Zoanthus sp2).
2.1. Пространственная структура.
2.2. Структура хромофора
ГЛАВА 3. ЗЕЛЁНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, zGFP506 {Zoanthus sp.)
3.1. Пространственная структура.
3.2. Структура хромофора
ГЛАВА 4 МУТАНТНЫЙ ВАРИАНТ zGFP506_N66D
ГЛАВА 5. ЖЁЛТЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, zYFP538 {Zoanthus sp.)
5.1. Пространственная структура.
5.2. Структура хромофора
5.3. Мутантные варианты
ГЛАВА 6. СТУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ОЛИГОМЕРИЗАЦИИ.
ГЛАВА 7 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
7.1. Выделение, очистка и кристаллизация белков.
7.2 Определение структуры, кристаллографическое уточнение.
7.3 Материалы, оборудование, программное обеспечение.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Клонирование в 1992г гена зелёного флуоресцентного белка (green fluorescent protein - GFP) и, позднее, других GFP подобных белков положило начало новой области исследований в клеточной биологии, биотехнологии и биомедицине, связанной с практическим использованием этих белков в качестве маркеров и генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоров (Глава 1. “Обзор литературы”)- В большинстве случаев, практическое применение флуоресцентных белков требует разработки мономерных мутантных вариантов с эмиссией в дальне-красной области спектра, обладающих высоким квантовым выходом, высокой скоростью созревания хромофора и фотостабильностью. Молекулярный механизм формирования хромофора и роль его аминокислотного окружения, как ближайшего, так и дальнего, в проявлении спектральных свойств флуорофора полностью не ясны. В этой связи, важно понять каким образом особенности стереохимии белка определяют его основные свойства, включая характеристики цветового спектра и установить ключевые остатки ответственные за формирование структуры мономера и олигомеризацию белка. Эти знания необходимы для разработки рационального подхода по созданию улучшенных вариантов белков, удовлетворяющих требуемым критериям. Биологические функции и фотофизические свойства этих объектов строго взаимосвязаны с их структурами. Поэтому, важный фундамент для успешного решения этой задачи создают исследования пространственной организации GFP подобных белков. В этой связи, фундаментальный и прикладной интерес для дальнейшего развития этой области представляет детальное изучение пространственных структур флуорофоров и молекулярных процессов их посттрансляционной модификации с целью направленного воздействия на их фотофизические свойства.

Предметом настоящей диссертационной работы являются рентгеноструктурные исследования на атомном уровне пространственных структур красного (zRFP574), зелёного (zGFP506) и жёлтого (zYFP538) флуорецентных белков из морского бутончатого полипа рода Zoanthus (семейство Zoanthids, класс Anthozoa; Рис. &) (Matz et al., 1999; Labas et al., 2002), а также генно-инженерного варианта ZGFP506 с заменой Asn66Asp (zGFP506_N66D).
Рис. & Отдельные разновидности морских бутончатых полипов рода Zoanthus (район Карибского моря). Полипы имеют животное происхождение, развиваются в симбиозе с микроскопическими одноклеточными фитопланктонами (Zooxanthellae) и образуют плотно заселенные колонии, прикрепляющиеся на общем основании к твердой основе. Полипы перерабатывают органическую субстанцию из водной среды, а также питаются морскими организмами (мелкие черви, креветки, яйца морского ежа и т.д.) Симбиотические растительные фитопланктоны превращают энергию солнца в пищу путем фотосинтеза.
Объекты исследования (231 аминокислотный остаток) с хромофоробразующими последовательностями в позиции 66-68, Asp-Tyr-Gly (zRFP574), Asn-Tyr-Gly (zGFP506) и Lys-Tyr-Gly (zYFP538), характеризуются резко отличающимися спектральными характеристиками с максимумами возбуждения/эмиссии 553/574 нм, 492/506 нм, 528/538 нм соответственно (Matz et al., 1999; Gurskaya et al., 2001a; Labas et al., 2002; Yanushevich et al., 2003). При общей величине ~78% идентичности аминокислотных последовательностей, выбранные белки являются прекрасными моделями для выявления

гЯР'Р574. Единственное исключение представляет остаток Пе44, боковая цепь которого в гСРРбОб принимает отличную от аналогичного остатка в гКРР574 ориентацию, предотвращая стерический конфликт с интактной боковой цепью Авибб.
Рис. 3.2 (а). Ближайшее аминокислотное окружение хромофора 7.СтРР506. Водородные связи (<З.ЗА) показаны синими штриховыми линиями, молекулы воды красными сферами и ван дер Ваальсовы взаимодействия (<3.9А) черными ‘ресничками’
(б) Стереоизображение системы Н-связей, образуемой аминокислотными остатками и молекулами воды в хромофорсодержащей полости гСРРбОб. Хромофор показан зелёным цветом, молекулы воды — розовым.
Полученные результаты указывают, что отличие природы остатка Аврбб хромофоробразующей триады в ЖГР574 от Авпбб в гСТРбОб является принципиально важным и по всей вероятности является определяющим в наблюдаемом резком различии процессов посггрансляционной модификации и спектральных характеристик зрелых хромофоров (Рис. 4.1 аЬ).