Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis

• Автор: Афанасьев, Максим Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 150 с. : ил.

Оглавление
Список используемых сокращений
Введение
1 Обзор литературы
1.1 Общая характеристика Mycobacterium tuberculosis
1.2 Туберкулезная инфекция
1.2.1 Основные факторы патогенности и патогенез туберкулеза
1.2.2. Эпидемиология туберкулеза
1.2.3. Лечение туберкулеза
1.3. Лекарственная устойчивость М. tuberculosis
1.3.1. Формирование устойчивости к различным
противотуберкулезным препаратам
1.3.2. Методы оценки лекарственной устойчивости М. tuberculosis
1.4. Современные подходы молекулярно-генетического и
эпидемиологического типирования популяции М. tuberculosis
1.5. Общие замечания
2 Материалы и методы
2.1 Бактериальные штаммы
2.1.1 Определение устойчивости штаммов
М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам
2.2 Генетический анализ
2.2.1. Выделение ДНК
2.2.2. Амплификация фрагментов генома .М tuberculosis
2.2.3. Подготовка продуктов амплификации для дальнейшего анализа
2.2.4. Минисеквенирование и масс-спектрометрический
анализ продуктов реакции
2.2.5. Секвенирование и анализ фрагментов генома
2.2.6. Анализ числа тандемных повторов в геноме (VNTR-типирование)
2.2.7. Сполиготипирование

2.3. Анализ дан ных
3 Результаты
3.1. Коллекция образцов клинических штаммов М. tuberculosis
3.2. Определение устойчивости к рифампицину, изониазиду, этамбутолу
3.3. Анализ генетических маркеров устойчивости М. tuberculosis
3.4. Типирование клинических штаммов М. tuberculosis и оценка гетерогенности популяции
3.4.1. VNTR-типирование
3.4.2. Сполиготипирование
4. Обсуждение
4.1. Коллекция образцов клинических штаммов М. tuberculosis
4.2. Определение устойчивости к рифампицину, изониазиду, этамбутолу
4.3. Анализ генетических маркеров устойчивости М. tuberculosis
4.3.1. Генетические маркеры устойчивости к рифампицину и изониазиду
4.3.2. Генетические маркеры устойчивости к этамбутолу'
4.4. Типирование клинических штаммов М. tuberculosis и оценка гетерогенности популяции
5 Заключение
6 Выводы
Список литературы

Список использованных сокращений
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения
ДНК - дезоксибибонуклеиновая кислота
дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат
ддНТФ - дидезоксинуклеотидтрифосфат
КОЕ - колониеобразующая единица
МИК - минимальная ингибирующая концентрация
п.о. - пар оснований
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
CDC - Center for Disease Control (Центр по контролю и профилактике заболеваний)
ETR - Exact Tandem Repeats (Точные тандемные повторы)
MALDI-TOF MS - Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight Mass-Spectrometry (времяпролётная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбционной ионизацией)
MDR - Multi-Drug Resistant (множесвенная лекарственная устойчивость) MIRU - Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (Микобактериальные рассеянные повторяющиеся единицы)
QUB - Queen University of Belfast (Королевский Университет Белфаста)
XDR - Extensively Drug-Resistant (широкая лекарственная устойчивость)

Дальнейшие исследования выявили прямую зависимость между наличием мутаций и возникновением устойчивых к рифампицину штаммов. Было обнаружено, что нуклеотидные замены, приводящие к устойчивости, в основном встречаются между 507 и 533 кодонами гроВ гена - до 96 % всех рифампицин - резистентных штаммов имеют мутации в этой области, так называемом регионе, определяющем устойчивость к рифампицину (англ. rifampin resistance determinant region (RRDR)). Наиболее часто (до 86 % случаев) встречаются замены в 531, 526 и 516 кодонах. Также была выявлена взаимосвязь между локализацией мутаций с уровнем устойчивости микроорганизма: мутации в 531, 526 и 513 кодонах приводят к устойчивости высокого уровня, замены в других кодонах связаны с умеренной устойчивостью [80, 91, 203].
Механизм устойчивости штаммов M.tuberculosis, не имеющих мутаций в гроВ-гене, остается пока неизвестным. Вероятнее всего, существует добавочный механизм устойчивости к рифампицину, возможно, связанный с нарушением проницаемости клеточной стенки для препарата или мутациями в других субъединицах РНК-полимеразы.
Изониазнд — еще один важнейший противотуберкулезный препарат первой линии, широко применяющийся для лечения различных форм туберкулеза, а так же для профилактики инфицирования. Оказывает бактерицидное действие на активно делящиеся микобактерии в аэробных условиях. Не действует на микроорганизмы, находящиеся в стадии покоя и в анаэробных условиях. В комбинации с рифампицином входит в состав практически всех терапевтических схем [72, 204].
Механизм действия изониазида на микобактерии более сложен, чем у рифампицина. Изониазид является иролекарством. Попадая внутрь микробной клетки, препарат под воздействием фермента каталазы-пероксидазы (KatG) превращается в активные формы - свободнорадикальные