Новая психрофильная протеиназа Serratia proteamaculans

• Автор: Хайруллин, Рафиль Фидаилевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 85 с. : 24 ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Serratia proteamaculans — представитель психротолерантных
грамотрицательных бактерий
1.2. Адаптация психрофильных ферментов к катализу при низкой 8 температуре
1.3. Олигопептидазы В. Структура, функция
1.3.1. Классификация
1.3.2. Распространение в природе
1.3.3. Структура олигопептидазы В
1.3.4. Каталитический домен
1.3.5. ß-Пропеллерный домен
1.3.6. Энзимологическая характеристика олигопептидазы В
Особенности олигопептидазного катализа
1.3.7 pH-Зависимость; pH- и температурная стабильность OpdB
1.3.8. Субстратная специфичность олигопептидаз В
1.3.9. Ингибиторы олигопептидазы В
1.3.10. Влияние реагентов на SH-группы на активность олигопептидаз В
1.3.11. Физиологическая функция олигопептидаз В и роль в патогенезе
II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Выделение и очистка трипсиноподобной протеиназы из
психротолерантного грамотрицательного микроорганизма S. proteamaculans.
2.2 Первичная структура PSP. Сравнение аминокислотных
последовательностей OpdB из различных источников.
2.3. Получение рекомбинантного PSP (His6-PSP)
2.4. Исследование pH-и температурной зависимости активности PSP
2.5. Субстратный анализ
2.6. Ингибиторный анализ

III ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ЗЛ. МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ
3.2. МЕТОДЫ
3.2.1. Определение концентрации белка
3.2.2. Электрофорез
3.2.3. Приготовление образцов для масс-спектрометрии
3.2.4. Определение активности препаратов PSP
3.2.5. Титрование активных центров
3.2.6. Определение химотрипсиновой активности

3.2.8. Получение BPTI-сефарозы
3.2.9. Процедуры, использованные при работе с клетками
3.2.10. Выделение и очистка трипсиноподобной протеиназы из психротолерантного грамотрицательного микроорганизма S. proteamaculans
3.2.11. Выделение и очистка рекомбинантного Hiss-PSP
3.2.12. Определение кинетических параметров гидролиза субстратов PSP
3.2.13. Определение температурной и pH-стабильности PSP
3.2.14. Определение рН-зависимости
3.2.15. Определение температурного оптимума PSP
3.2.16. Гидролиз мелиттина
3.2.17. Определение содержания Zn2+ в PSP ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Abz - о-аминобеызоил
BAPNA - a-N-6eH30njL-DL-api HHHii 4-нитроанилид;
BPTI - основной панкреатический трипсиновый ингибитор быка;
FRET - резонансный перенос энергии флуоресценции
HEPES - К'-2-гидрокси-э гилпиперазин-К-этансульфоновая кислота;
OpdB - олигопептидаза В
PSP - протеиназа из Serratia proteamaculans
STI - ингибитор трипсина из бобов сои;
Z-Lys-S-Bzl - тиобензиловый эфир и-М-бензошюксикарбонил-Е-лизина;
АКТГ - адренокортикотропный гормон
АНФ - атриальный натрийуретический фактор
ДМСО - диметилсульфоксид;
ДТДП - 4,4’-дитиодипиридин;
ДФФ - диизопропилфторфосфат;
ТЛХК -тозил-Ь-лизилхлорметилкетон;
Трнс - трис(гидроксиметил)аминометан;
ТФУ - трифторуксусная кислота;
ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

T. brticei, за исключением устойчивости к гидролизу субстрата с остатком Glu, не наблюдалось [105].
На основании полученных результатов Хемерли и соавт. [105] синтезировали оптимальные субстраты: Abz-AHKRYSHQ-EDDnp (kcJKm = 41,071 мкМ'1сек'1) для OpdB T. cruzi и Abz-AMRRTISQ-EDDnp (кся1 ! Кт = 79.13 мкМсек"1) для OpdB T. brucei.
Для многих субстратов OpdB E. coli было обнаружено отклонение кинетики от михаэлисовской в области высоких концентраций субстрата, соответствующее ингибированию субстратом, когда его вторая молекула связывается с фермент-субстратным комплексом, образуя неактивный тройной комплекс.
кт cat
ES —►
+S ! j г k Ks'

При этом начальная скорость гидролиза соответствует уравнению: V = ксМ [Е] ШКт + [Б] + [Б]2/ КБ’) (2), где КБ’— константа диссоциации этого неактивного комплекса. Такое субстратное ингибирование было обнаружено для некоторых субстратов с парой остатков аргинина: Z-Arg- А-АМС [60] и АЬ2-Т11г-Аг§-А-Р1:1е(ЬГО2)-8ег-1_,еи-ЫН2 (субстрат Ш1 [77] (рис. 10).
Наличие четырех карбоксильных аминокислотных остатков в двух субстрат-связывающих центрах ОрйВ делает вполне вероятным связывание дополнительной молекулы субстрата, как с двумя положительно заряженными остатками, так, тем более, и с одним. Оказалось, что субстраты СЯ и ЯС, где один из остатков А заменен на незаряженный остаток цитруллина, также склонны к субстратному ингибированию, однако зависимость начальной скорости гидролиза от концентрации субстрата не подчиняется уравнению (1) [77]. В случае более коротких субстратов и-нитроанилида и (3-нафтиламида И-бензоил- аргинина (ВАРНА и Вг-А-рИА, соответственно) субстратное ингибирование также не соответствовало механизму с образованием нективного комплекса фермента и двух молекул субстрата [111]. Механизм такого необычного ингибирования выяснен не был.