Характеристика дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. finitimus

• Автор: Левитин, Евгений Ильич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

Содержание
Введение
Обзор литературы: Регуляция синтеза дельтаэндотоксинов и формирование энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis
I Общая характеристика Bacillus thuringiensis
II Факторы, ответственные за энтомоцидную активность В. thuringiensis
III Структурная организация Cry
белков
IV Мобильные генетические элементы Bacillus thuringiensis
V РеГуЛЯЦИЯ ЭКСПреССИИ СГу
генов
1. Транскрипционные механизмы регуляции экспрессии cry генов: а) Экспрессия cry генов, зависимая от
споруляции
б) Экспрессия cry генов, независимая от споруляции
2. Механизмы посттранскрипционной регуляции Экспрессии дельта-эндотоксинов
3. Механизмы посттрансляционной регуляции синтеза дельта-эндотоксинов
4. -Влияние белок-белковых взаимодействий и шаперон-подобных белков на фолдинг дельта-эндотоксинов
5. Пространственная организация экспрессии генов дельта-эндотоксинов и механизмы, принимающие участие в
кристаллообразовании
Материалы и методы
Результаты
I. Морфологическое исследование штамма Bacillus
thuringiensis подвида finitimus В-1166 VKPM и получение
сегрегантов, отличающихся расположением кристаллических шел включения

1) Микроскопическое изучение морфологии штамма
Bacillus thuringiensis подвида finitimus В-1166
VKPM
2) Получение сегрегантов штамма штамма Bacillus
thuringiensis подвида finitimus В-1166
VKPM
II. Изучение белкового состава кристаллов исходного штамма
III. Определение N-концевой аминокислотной последовательности истинных токсинов
IV. Изучение белкового состава кристаллов сегрегантов со свободными и сцепленными кристаллами
V. Исследование генома штамма В-1166 VKPM Bacillus thuringiensis ssp. finitimus при помощи универсальных праймеров
для выявления cry генов
VI. Конструирование геномного банка и клонирование гена cry26Aal
VII. Анализ последовательности клонированного фрагмента и структура геномного локуса гена сгу26Аа
VIII. Определение уникальности геномного окружения гена cry26Aal
IX. Экспрессия гена cry26Aal в E.coli
Обсуждение результатов
Выводы
Заключение
БЛАГОДАРНОСТИ
Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

Род Bacillus и близкие группы грамположительных бактерий широко распространены в природе. Эти микроорганизмы используются в производстве антибиотиков, ферментов и других биологически активных веществ. Изучение регуляции процессов роста и споруляции представителей рода Bacillus (в частности Bacillus subtilis) стало основой выявления механизма долговременного переключения системы промоторов, представляющего собой первый детально изученный на молекулярном уровне случай необратимой дифференциации клетки. Некоторые бациллы (такие как Bacillus antracis) могут вызывать инфекционные заболевания человека и животных. Один из видов бацилл, Bacillus thuringiensis, известен своими энтомоцидными свойствами и широко используется' для создания биопестицидов с высокой избирательностью в отношении различных видов насекомых.
Среди энтомоцидных факторов, вырабатываемых клетками В.thuringiensis, наиболее важную роль играет группа родственных белков, называемых Cry белками или дельта- эндотоксинами. В ходе споруляции или, как в случае белков CryЗА, в поздней стадии вегетативного роста дельта- эндотоксины формируют видимые в световой микроскоп кристаллические тела включения, расположенные обычно рядом со спорой внутри материнской клетки. После лизиса материнской клетки смесь кристаллических включений и спор высвобождается во внешнюю среду.
Кристаллические включения В.thuringiensis, могут составлять „ более 25% от сухого веса с.порулирующей клетки В. thuringiensis. Подобный синтез требует участия в нем значительной доли клеточных ресурсов и, тем не менее, споруляция и связанные с ней клеточные процессы проходят параллельно с синтезом дельтаэндотоксинов (Aronson,1993). Высокая продукция Cry- белков является уникальным случаем природной суперэкспрессии. Механизм, обеспечивающий столь высокий уровень устойчивой продукции интересен с точки зрения разработки эффективных систем гетерологической экспрессии.
5. Пространственная организация экспрессии генов S-эндотоксинов и механизмы, принимающие участие м кристаллообразовании.
Как уже говорилось выше, закладка и формирование кристаллов в абсолютном большинстве штаммов В. thuringiensis происходит, начиная со стадии 4 в цитоплазме материнской клетки, в результате чего кристалл оказывается в конечном итоге за пределами споровых оболочек (al-Yahyaee 1997, SA, et al. Debrot, 1986). Через некоторое время после окончания споруляции оболочка материнской клетки, содержащая сформированные кристалл и спору, механически повреждается и деградирует (Aronson, 1993). Обращает на себя внимание то обстоятельство, что в каждой клетке В. thuringiensis формируется лишь один кристалл каждого типа, при этом различные по структуре белки одного класса всегда кристаллизуются вместе (Sanchis,1988, 1989). У штаммов подвида
israelensis при этом образуются так называемые "аморфные" кристаллы, в реальности представляющие собой агломераты многочисленных истинных кристаллов, по видимому, содержащих токсины различных типов (Adams, 1989). Такая организация кристаллов подвида israelensis связана, по-видимому, с присутствием в них гемолизина CytlA, радикально отличающегося по структуре от 8-эндотоксинов. В то же время, даже наиболее различающиеся по первичной структуре белки Cry одного класса в большинстве подвидов неизменно формируют общий кристалл, обладающий по данным Baum (1991) истинной кристаллической решеткой. Данная ситуация является весьма необычной с точки зрения кристаллографии, она свидетельствует о большом консерватизме третичной структуры 8-эндотоксинов.
В то же время, свойства белковой молекулы сами по себе не обеспечивают формирования единственного кристалла на клетку, что наглядно продемонстрировано в опытах Севера и соавт (Север и др., 1990). Данные авторы вводили с использованием природной конъюгативной плазмиды ген crylAbl из штамма berliner 1715 в клетки В. megaterium. При этом наблюдалась высокоэффективная продукция 5-эндотоксина, строго зависимая от споруляции, с выходом белка до 5 г на литр культуры. Продукт имел характерный