Исследование функциональных свойств аутоантител к ДНК

• Автор: Козырь, Арина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л. Развитие представлений об аутоиммунности
и современные исследования аутоантител
1Л Л. История исследований аутоиммунности
1Л.2. Роль аутоантител при аутоиммунных патологиях
1Л .3. Природные аутоантитела: специфичность, происхождение, генетические данные
1.2.1. Механизмы образования антител к ДНК
1.2.2. Специфичность антител к ДНК
1.2.3. Аутоантитела к В-ДНК и одноцепочечной ДНК
1.3. Природные каталитические антитела
1.4. Аутонтитела при лимфопролиферативных заболеваниях
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Выделение и очистка фрагментов иммуноглобулинов G
2.2.2. Разделение Fab и Fc фрагментов иммуноглобулинов G
2.2.3. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле и окрашивание полиакриламидных гелей
2.2.4. Иммуноблот
2.2.5. Реакция релаксации суперскрученной плазмидной ДНК
2.2.6. Выделение плазмидной ДНК
2.2.7. Электрофорез в агарозном геле

2.2.8. Анализ препаратов антител на связывание ДНК и определение константы связывания ДНК с антителами
2.2.9. Анализ ассоциированности ДНК-гидролизующей активности с антителами методом аффинной сорбции
2.2.10. Выделение ядерного матрикса и приготовление аффинного сорбента на основе белков ядерного матрикса
2.2.11. Культура эукариотических клеток и анализ цитотоксического эффекта антител
2.2.12. Анализ цитоплазматической фракции клеток на наличие фрагментов ДНК
2.2.13. Анализ проникновения антител в клетку флюоресцентной микроскопией
2.2.14. Выделение мембранных белков и анализ кросс-реактивности ДНК-гидролизующих
антител с мембранными белками и белками ядерного матрикса
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка методики выделения каталитических аутоантител к ДНК и связь ДНК-гидролизующей акивности с РаЬ-фрагментом антител
3.2. Определение константы связывания ДНК-гидролизующих антител с ДНК
3.3. Метод аффинной сорбции для определения ДНК-гидролизующей активности антител и распределение ДНК-гидролизующих антител в сыворотках крови больных системной красной волчанкой (СКВ) и лимфопролиферативными заболеваниями
3.4. Взаимодействие ДНК-гидролизующих антител с белками ядерного матрикса
3.5 Цитотоксический эффект аутоантител к ДНК
ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

ВВЕДЕНИЕ
Исследования последних десятилетий значительно расширили представления молекулярных биологов и медиков о свойствах аутоантител. Возникновение этих антител, обладающих способностью связывать собственные антигены организма, как правило, сопряжено с развитием целого ряда тяжелейших заболеваний, получивших название аутоиммунных. Громадное количество проведенных исследований позволило точно установить связь появления аутоантител с развитием аутоиммунных заболеваний, а в ряде случаев установить и механизмы их участия в патологическом процессе.
Примечательно, что аутоантитела обнаруживаются не только при заболеваниях чисто аутоиммунной природы. Повышенный уровень аутоантител наблюдается при ряде лимфопролиферативных заболеваний, а также заболеваниях инфекционной природы (СПИД, гепатиты), и в этом случае они, безусловно, также вносят свой вклад в развитие патологического процесса. Поскольку особенностями большинства лимфопролиферативных заболеваний в той или иной мере являются нарушения нормальной работы иммунной системы, появление повышенного уровня аутоантител при этих заболеваниях вполне обосновано, однако конкретные причины, вызывающие сопряженный с лимфопролиферацией аутоиммунный процесс, еще не выяснены и требуют дальнейших исследований. Изучение свойств аутоантител и выявление их роли при различных лимфопролиферативных процессах открывают широкие перспективы для установления этих причин и могут внести свой вклад в разработку подходов к диагностике и терапии опухолей крови. С другой стороны, данные о развитии аутоиммунных процессов, причинах образования и свойствах аутоантител помогают понять базовые механизмы
функционирования здоровой иммунной системы и ее влияние на работу других систем организма.

активность ассоциирована с антителами: - электрофорез препаратов антител, выделенных из активных сывороток, в денатурирующих условиях с последующим окрашиванием серебром показал наличие только двух белковых полос, соответствующих по молекулярному весу L- и Н-цепям IgG; - гидролитическая активность количественно задерживалась при пропускании препарата антител через колонку с иммобилизованным Protein G - бактериальным белком, связывающим Fc-участок IgG, а так же исчезала при добавлении к препарату антител к человеческому IgG; - гидролитическая активность была ассоциирована с пиком, соответствующим по своей хроматографической подвижности фракции IgG; - Fab фрагмент антител обладал гидролитической активностью; - после ультрафильтрации на фильтрах с размерами пор 100 кД и 30 кД, а так же после гель-фильтрации при pH 2.7 (в таких условиях любой нековалентный белковый комплекс должен разрушаться) препарат антител сохранял гидролитическую активность, что свидетельствует об отсутствии в нем загрязняющих протеаз; - после аффинной хроматографии на иммобилизованном ВИП в некаталитических условиях гидролитическая активность препаратов многократно возрастала, что свидетельствовало о высокой специфичности гидролиза [136]; - значения Кт для реакции гидролиза составили от 2.2х10"6 до 3.8х10'8 М, что указывало на значительно более прочное по сравнению с известными протеазами связывание субстрата.
Были определены сайты гидролиза ВИП антителами. Для этого исходный ВИП инкубировали с препаратом выделенных из активных сывороток антител, после чего полученные продукты разделяли ВЭЖХ и идентифицировали N-концевым секвенированием. Оказалось, что антитела, выделенные из различных сывороток, обладают неодинаковой специфичностью. Исследованные первыми антитела донора Д1 гидролизовали единичную связь Gin16 -Met17 , что позволяло надеяться на исключительно высокую специфичность обусловленного антителами гидролиза [135]. Однако антитела доноров Д2 и ДЗ гидролизовали ВИП по шести и семи сайтам соответственно: шесть общих