Миоглобин как восстановительный реагент в биологических системах : Кинетика и механизм редокс-реакций миоглобина с низкомолекулярными акцепторами электрона и цитохромом С

• Автор: Моисеева, Светлана Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 94 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2Л. Окислительно-восстановительные реакции гемсодержащих белков с ионами и комплексами металлов 2.1Л. Редокс-реакции гемсодержащих белков с комплексами железа
а) Цитохром С
б) Белки - переносчики кислорода 15 2Л .2. Окисление гемсодержащих белков ионами и комплексами
двухвалентной меди
а) Цитохром С
б) Белки - переносчики кислорода 25 2.2. Белок-белковый перенос электрона'в реакциях миоглобина и
гемоглобина с другими гсмсолсржашимй белками
2.2.1. Взаимодействие гемоглобина с цитохромом С
2.2.2. Взаимодействие миоглобина с цитохромом С
2.2.3. Взаимодействие миоглобина и гемоглобина с цитохромом Ь5
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Получение интактных и химически модифицированных белков
3.2. Кинетические измерения
3.3. Выделение и инкубация митохондрий
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Окисление оксимиоглобина кашалота, катализируемое ионами 47 ферроцианида
4.2. Механизм окисления оксимиоглобина ионами меди: сравнение 58 миоглобинов кашалота, лошади и свиньи

4.3. Каталитический эффект феррицианида на скорость переноса 68 электрона между миоглобином и цитохромом С
4.4. Влияние митохондрий на окисление миоглобина цитохромом С
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ
Миоглобин - один из белков-переносчиков кислорода семейства глобинов, осуществляющий снабжение кислородом мышечных клеток и обеспечивающий таким образом возможность протекания в них окислительных процессов. Широкая распространенность Mb, доступные методы выделения и возможность получения в больших количествах, а также определение пространственной структуры сделали его популярным объектом для изучения и демонстрации молекулярных механизмов функционирования гемсодержащих белков. В настоящее время накоплен огромный материал о структуре, физико-химических и функциональных свойствах этого белка.
Поддержание восстановленного состояния гемового комплекса в Mb и НЬ очень важно для их функционирования, так как окисленные формы белков не способны связывать кислород. Кроме того, окисление Fe гема является первой стадией денатурации Mb и НЬ, так как сродство глобина к окисленному ферригему существенно меньше, чем к восстановленному. В то же время известно, что в аэробной среде окси-Mb и окси-Hb способны самопроизвольно окисляться, особенно быстро при кислых pH (автоокисление), образуя физиологически неактивные ферри-формы этих белков - мет-Mb и мет-Hb [Brantley и др., 1993]. Ферро- и феррипроизводные Mb и НЬ легко вступают также в окислительновосстановительные реакции с солями и комплексами различных металлов. Наибольший интерес представляют редокс-реакции Mb с соединениями железа и меди, так как эти металлы участвуют во многих метаболических процессах в организме. Железо входит в состав простетических гемовых групп, которые содержатся в целом ряде важнейших ферментов - каталазе и пероксидазе, цитохроме Р-450, цитохромоксидазе, митохондриальных белках - переносчиках электронов, цитохроме С и других цитохромах. Кроме того, железо является составной частью железо-серных кластеров ферментов, участвующих в процессах дыхания, азотфиксации и фотосинтеза в клетках животных, растений и бактерий. Медь также активно участвует в метаболизме, входя в состав активных центров таких ферментов как азурины, пластоцианины и различные оксидазы - о-дифенол-оксидаза, аскорбат-оксидаза, цитохромоксидаза и др.. В целом ряде работ продемонстрирована существенная роль меди и железа в механизмах окислительного стресса.

переносчиков [Зи и др., 1972]. Так как скорость реакции в анаэробных условиях намного больше, чем в присутствии кислорода, авторы заключают, что донором электрона для СлТ С является только дезокси-МЬ. Из анализа пространственных структур МЬ и СуТ С, полученных с высоким разрешением [Такапо, 1977; Такапо и др., 1977], следует, что непосредственный контакт между темами двух молекул невозможен и можно предполагать участие белковых групп в механизме реакции. Реакция должна протекать через образование короткоживущего МЬ - СТ С электрон-переносящего комплекса, так как стабильного комплекса между белками обнаружить не удается.
Редокс-реакция между ферри-Су! С и ферропроизводными МЬ является удобной моделью для исследования механизма белок-белкового переноса электрона, так как физико-химические свойства и пространственные структуры этих белков наиболее хорошо изучены. Перенос электрона в системе МЬ - Су! С детально изучен при разных экспериментальных условиях (pH, ионная сила, разные лигандные производные МЬ, интактные и химически модифицированные белки и т.д.) [Постникова, 1986, 1992 и ссылки там].
Показано, что редокс-реакция между МЬ и С)Т С происходит не при любом соударении белковых молекул, а только при контакте определенных участков их поверхности. Контактные участки обоих белков локализованы, определена их пространственная структура и исследованы факторы, влияющие на образование эффективного МЬ - Су! С-электрон-переносящего комплекса, и его структура [Постникова, Докт. дисс., Пущино, 1992].
Контактный участок МЬ идентифицирован при изучении скоростей восстановления Су! С в реакциях с химически модифицированными оксимиоглобинами при разных значениях pH и ионной силы среды. Изучено влияние на скорость реакции избирательной модификации Ы-концевой и-М1Ь грз'ппы МЬ изотиоцианатными реагентами (М1ТС, Г’П'С). остатков 1 Пн бромацетатом и иодацетамидом и комплексирования Шб! 19 с ионом цинка [Постникова и др., 1981, 1982, 1992]. Показано, что МЬ контактирует с Су! С в области А-В-ОН (Рис.6), где в МЬ кашалота локализованы 1Ь.ч12(А10) и Шз119(0111), а в МЬ из сердца свиньи только последний. Протонирование 1Ьз119 способствует переносу электрона от МЬ к Су! С, а ионизация НААЮ, наоборот, ухудшает это взаимодействие. Помимо гистидинов в контактном участке МЬ кашалота локализованы катионные группы Ьуз 16(А 14), А118(019), а также анионные группы 01 и! 8(А16), Азр20(В1), 27(В8), 122(ОН4), 126(НЗ) (Рис.7). В МЬ