Стабилизация бактериальной формиатдегидрогеназы гидрофобизацией белковой глобулы методом направленного мутагенеза

• Автор: Рожкова, Александра Михайловна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с.

СОДЕРЖАНИЕ
I. ВВЕДЕНИЕ
И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА Г ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА, СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ NAEP-ЗАВИСИМОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ
1.1 Физико-химические свойства ЫАО+-зависимых формиатдегидрогеназ из различных источников
1.2 Сравнение аминокислотных последовательностей NAlV-зависимых формиатдегидрогеназ
1.3 Третичная структура NAD*-зависимой формиатдегидрогеназы из Pseudomonas spAOl
1.4 Практическое применение NAD -зависимой формиатдегидрогеназы
1.5 Механизмы инактивации ФДГ при различных температурах
ГЛАВА 2. СТАБИЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ МЕТОДАМИ БЕЛКОВОЙ ИНЖЕНЕРИИ.
2.1 Различные подходы к увеличению стабильности белков
2.2 Анализ подходов к повышению стабильности белков с использованием методов белковой инженерии
2.3 Повышение гидрофобности белковой глобулы
2.4 Создание стабильных белков введением нескольких мутаций
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Материалы
3.2 Методы исследования
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 4. ГИДРОФОБИЗАЦИЯ а-СПИРАЛЕЙ
4.1 Направленный мутагенез остатков Serl31, Serl60, Serl68, Serl84 и Ser228
4.2 Двойные замены Serl31/160Ala и Serl84/228Ala
4.3 Точечные замены Tyr62Phe и Tyrl65Phe

4.4 Точечные замены 8ег147А1а, 8ег147Уа1, 8ег147ТЬг
ГЛАВА 5. ВЫТЕСНЕНИЕ МОЛЕКУЛ ВОДЫ ИЗ ОБЛАСТЕЙ ГИДРОФОБНЫХ КОНТАКТОВ
5.1 Точечная замена А1а294Уа1
5.2 Замена А1а172Уа1
5.3 Двойная замена А1а172/294Уа1
ГЛАВА 6. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА МНОГОТОЧЕЧНЫХ МУТАНТОВ
6.1 Кинетические свойства мутантов ФДГ: Т4, Т5, Тб и А1а294Уа1
6.2 Исследование термоинактивации нативной ФДГ и мутантов Т4, Т5, Т6? А1а294Уа1 в диапазоне температур Т = 60-70°С
6.3 Количественный анализ степени аддитивности мутантов
6.4 Температурная зависимость активности нативной ФДГ и ее мутантов Т4, Т5, Тб и А1а294Уа1 в диапазоне температур Т=25-45°С
6.5 Применение стабилизирующих мутаций для очистки
формиатдегидрогеназы
V. ВЫВОДЫ
VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ЫАО+ - никотинамидадениндинуклеотид окисленный
МАБН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
МАБР+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный
ЫАБРН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
ФДГ - формиатдегидрогеназа
АДГ - алкогольдегидрогеназа
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
МДГ - малатдегидрогеназа
ГАФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
ИПМДГ - 3-изопропилмалатдегидрогеназа
АТФ - аденозин-5 -трифосфат
сЮТР - дезоксирибонуклеозид -5 -трифосфат
ИПТГ - изопропилтио-Р-Б-галактозид
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ДТТ - дитиотреитол

является универсальным, так как замена Lys на Arg характерна при переходе от белков из мезофилов к их термофильным гомологам [70, 71].
Создание дополнительных водородных связей.
Водородные связи, наряду с солевыми мостиками, также важны для термостабильности [70, 87]. Несмотря на это, примеры стабилизации белков при создании дополнительных водородных связей встречаются в литературе достаточно редко. Например, мутация Ser82Arg вызвала увеличение термостабильности ИПМДГ: температура, при которой фермент инактивируется на 50% за 10 мин, увеличилась в результате замены на 7 °С [92]. Стабилизация объясняется формированием водородной связи между остатками Arg82 и Glu87 через мостиковую молекулу воды. Остаток Ser в 82 положении был слишком мал, чтобы .участвовать в подобном контакте. Образование водородной связи между Glnl72 или Asnl72 с His300 и Lys75 наблюдается при стабилизирующей замене Ala 172 на Gin и Asn в ИПМДГ из Thermus thermophilus [89]. Однако, как было упомянуто ранее, повышение термостабильности в этом случае, главным образом, связывается с гидрофобными контактами метиленовых групп боковых цепей аминокислот.
Для определения термодинамического вклада от введения полярных групп внутрь белкового ядра была получена серия мутантов лизоцима фага Т4, содержащих девять замен Ala->Ser и три замены Val->Thr в а-спиралях белка [93]. Все мутанты оказались менее стабильными, чем нативный фермент. Энергетический проигрыш для положений, имеющих контакт с растворителем, составил около 0,5 ккал/моль, а для скрытых от растворителя положений достигает 3 ккал/моль. Полученный результат доказывает сложность задачи по введению дополнительных водородных связей в белок.
Другие подходы к увеличению термостабильности белков.
В литературе встречаются примеры аминокислотных замен, которые стабилизируют белки, но не могут быть включены ни в один из разделов