Пространственная структура димарганцевой каталазы Thermus thermophilus с разрешением 1 A

• Автор: Антонюк, Светлана Владимировна
• Шифр специальности: 01.04.18
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с.

Содержание.
Введение
Глава 1. Марганцевые кластеры в белках (по литературным данным)
1. Введение. Роль марганца в живой природе.
2. Химическая природа геометрическая координация ионов Мп в марганецсодержащих белках
2.1. Координационные связи иона Мп с азотами имидазола гистидина
2.2. Координационные связи иона Мп с кислородами карбоксильных групп
2.3. Экзогенные лиганды
3. Природные белки, содержащие ионы марганца в активном центре
3.1.Аргиназа из печени крысы
3.2. Пролин специфическая аминопептидаза (АМРР) из Escherichia Coli
3.3. Протеиновая фоефатаза
3.4. Супероксиддисмутаза (СОД)
4. Димарганцевые каталазы
4.1. Первичная структура димарганцевой каталазы из Thermits thermophilus
4.2. Магнитные свойства Мп кластеров в марганцевых каталазах
4.3. Влияние анионов на окислительное состояние и активность димарганцевой каталазы
4.4. О механизме действия димарганцевой каталазы
Глава 2. Исследования каталазы с использованием метода Электронного Парамагнитного Резонанса
1. Введение
2. Материалы и методы
2.1. ЭПР - измерения

2.2. Ферментативная активность
2.3. Оценка относительного содержания активных центров в различных состояниях окисления
2.4. Влияние перекиси водорода на различные окислительных состояния биядерного кластера
2.5. Обсуждение
Глава 3. Рентгеноструктурные исследования димарганцевой каталазы из Пегти5 1кеппоркИш
1. Пространственная структура димарганцевой каталазы при разрешении 1.4 А
2. Определение структуры нативного фермента и ингибированного ионами хлора с атомным разрешением 1.05-0.98 А
2.1. Материалы и методы
2.1.1. Кристаллизация
2.1.2. Применение метода многократного перемораживания к кристаллам димарганцевой каталазы и его усовершенствование
2.1.3. Сбор и обработка экспериментальных данных
2.2. Уточнение пространственной структуры димарганцевой каталазы
2.2.1. Уточнение и достраивание атомной модели фермента. Общая стратегия
2.2.2. Уточнение структуры нативного фермента
2.2.3. Уточнение структуры ингибированного фермента
Глава 4. Описание и анализ атомной модели димарганцевой каталазы
1. Анализ качества модели
2. Водородные связи внутри субъединицы
3. Сульфат ионы и ионы Ы+ и их окружение
4. Различия в структуре субъединиц, связанных некристаллографической

симметрией
5. Сравнение структур димараганцевой каталазы в кислых и щелочных условиях
6. Пространственная структура активного центра димарганцевой каталазы. Сравнение активных центров нативного и ингибированного фермента
7. Каналы
8. Сравнение структуры и строения активного центра суперо кислен ной димарганцевой каталазы (Мп3+, Мп4+) со структурой нативной димарганцевой каталазы (Мп3+, Мп3+)
Глава 5. Обсуждение результатов
1. Отличия активного центра димарганцевой каталазы от активных центров других ди-марганцевых ферментов
2. Несоответствия предложенного ранее механизма ферментативной реакции пространственной структуре активного центра димарганцевой каталазы
3. Механизм действия димарганцевой каталазы с учетом пространственной структуры активного центра
Основные результаты и выводы
Благодарности
Список цитируемой литературы
Приложение А. Ионные радиусы обсуждаемых в диссертации ионов
Приложение В. Контакты между мономерами К и Г внутри димера КЬ
Приложение С. Внешние контакты димера КЬ
Приложение И. Список употребляемых в диссертации сокращений

замещается ди-р-флюоридо мостиками и освобождением двух ОН' при связывании флюорида [59]. Один р-гидроксомостик и одно р-мостиковое место для связывания анионов и наличие двух р-карбоксилатов было предположено для димарганцевой каталазы [60]. Исследования димарганцевой каталазы в каталитически неактивном состоянии (Мп3+,Мп4+) EXAFS методом показали уменьшение расстояния между Мп до 2.7 Â, что свойственно образованию ди-р-оксо-мостиков [61]. Наличие ди-р-оксо-мостиков было также подтверждено температурной зависимостью сигналов ЭПР [62] и электронными спектроскопическими исследованиями [63]. Электронно-ядерный двойной резонанс и электронные спин-эхо исследования димарганцевой каталазы в состоянии окисления
(Мп+3,Мп+4) доказали, что большинство лигандов Мп имеют магнитный момент,
показывающий на недостаток протонов в первых трех координационных оболочках, что предполагает наличие в качестве лигандов Мп карбоксильных остатков Glu, Asp или кислорода. Единственный азотный лиганд так же определен методом электрон-спин-эхо, это может быть или гистидин или р-мостиковый лизин [64].
4.3. Влияние анионов на окислительное состояние и активность димарганцевой каталазы [65].
Константа скорости разложения перекиси водорода препаратами димарганцевой каталазы T.thermophilus при 20°С составляет 107 M'lc_1. Фермент обладает максимальной активностью
в восстановленном состоянии (Мп2+,Мп2+) в интервале pH 7- 10 и теряет свою активность при окислении (рис.21).
Рис.21 Активность димарганцевой каталазы в 5 мМ фосфатном буфере. Концентрация фермента 0.083 пМ, [H202]=3mM.

10 1Î