Исследование светорассеивающих свойств несферических биологических частиц с использованием сканирующей проточной цитометрии

• Автор: Швалов, Александр Николаевич
• Шифр специальности: 01.04.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 98 с.

ВВЕДЕНИЕ
1 СКАНИРУЮЩИЙ ПРОТОЧНЫЙ ЦИТОМЕТР
1.1 Методы определения параметров сканирующего проточного цитометра в однотриггерной конфигу рации
1.2 Программное обеспечение сканирующего проточного цитометра
1.2.1 Управление системой сбора данных сканирующего проточного цитометра
1.2.2 Обработка результатов измерений сканирующего проточного цитометра
1.3 Ориентация несферических частиц в гидродинамической системе цито метра
1.3.1 Параболический профиль скоростей
1.3.2 Сужающаяся (расширяющаяся) труба
2 РАСЧЕТЫ ПОЛЯ РАССЕЯНИЯ И РЕШЕНИЕ ОБРАТНОЙ ЗАДАЧИ
СВЕТОРАССЕЯНИЯ ДЛЯ НЕСФЕРИЧЕСКИХ ЧАСТИЦ
2.1 Особенности формирования индикатрисы одиночной несферической частицы
2.1.1 Использование ВКБ приближения для расчета индикатрис рассеяния одиночными двояковогнутыми дисками в произвольной ориентации
2.1.2 Расчет индикатрис светорассеяния для вытянутых сфероидов вращения методом Т-матриц
2.2 Обратная задача светорассеяния для ориентированных сфероидов вращения
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВЕТОРАССЕИВАЮЩИХ СВОЙСТВ НЕСФЕРИЧЕСКИХ ЧАСТИЦ
3.1 Классификация латексных частиц на сканирующем проточном цитометре
3.2 Рассеяние света эритроцитами человека
3.3 Рассеяние света бактериями Е.соИ
3.3.1 Параметризация обратной задачи светорассеяния для сфероидальных частиц
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРА

Введение.
Дисперсные системы широко распространены как в живой, так и в неживой природе. Существует два принципиально разных подхода при исследовании дисперсных систем: исследование системы как целого, и изучение отдельных составляющих. При относительной простоте проведения исследований дисперсионной системы как целого, интерпретация результатов, полученных при таком подходе, является сложной задачей. Исследование же отдельных составляющих частей системы дает наиболее полную информацию о системе.
Например, анализ изображения в микроскопии позволяет не только классифицировать его, но и определить множество физических параметров (размеры, внутреннюю структуру, показатели преломления составляющих и т.д.). С другой стороны микроскопические методы позволяют лишь исследовать небольшие количества частиц дисперсной среды, и с их помощью невозможно накопить данные в статистически надежных количествах при исследовании редких событий. Кроме того, микроскопические исследования являются довольно трудоемким процессом.
С бурным развитием лазерной техники, систем автоматизации исследований и методов обработки данных стали стремительно развиваться методы исследования отдельных составляющих дисперсных системы. Среди них широкое распространение получили два метода, позволяющих исследовать систему частиц с большой статистической точностью, а именно, проточная цитометрия [1] и метод Култера [2]. Благодаря большой скорости регистрации параметров одиночных частиц (до 105 сек'1), эти методы представляют огромный шаг вперед по сравнению с микроскопическими методами.
До недавнего времени, количество измерений одной частицы, регистрируемых на проточных цитометрах, ограничивалось сигналами рассеяния в два телесных угла и сигналами флюоресценции на различных длинах волн. При таких методах регистрации стало возможным произвести классификацию составляющих дисперсной системы на подсистемы. Однако, определение же морфологических параметров той или иной подсистемы с использованием стандартного проточного цитометра, даже в простейшем
случае, гомогенной сферической частицы, представляют собой сложнейшие процедуры с тщательной калибровкой системы [3].
Развитие быстрых методов определения морфологических параметров несферических объектов очень важно для медицины, биологических исследований, и т.д. Цитометрия, например, позволяет значительно ускорить изучение влияния антибиотиков на рост популяции клеток [4, 5].
Однако, как и при классификации, так и при определении параметров частиц, форма которых отлична от сферической, возникают большие дополнительные трудности. Кроме роста числа определяемых параметров, появляются сложности, связанные с ориентацией объекта относительно направления подающего излучения. При исследовании несферических частиц возможно лишь определение некоторых, усредненных по множеству частиц, параметров. Такой подход возможен лишь в том случае, когда а priori известно, что разброс в морфологии частиц лежит в узких пределах, что далеко не всегда выполняется.
Например, в 1972 году Кроссом [6] впервые была измерена угловая зависимость интенсивности рассеянного на взвеси клеток Escherichia coli света. При интерпретации результатов использовалось приближение Релея - Ганса - Дебая, в котором использовались значения объема частиц, измеренные с помощью Култер метода.
Позднее группой Бронка исследовались поляризационные свойства взвесей палочкообразных бактерий Escherichia coli и Bacillus Subtilis. Экспериментально
измеренное положение второго максимума в комбинации элементов матрицы Мюллера
5, + S
-4 - 14 использовалось [7, 8] для определения усредненного диаметра частиц взвеси.
5П + Л]3
Связь этой комбинации элементов матрицы Мюллера и параметров частиц определялась из сопоставления с данными микроскопии [8] и результатов расчета методом связанных диполей [9].
Де Гроссом [10, 11] на примере исследования белых кровяных телец было показано, что применение поляризационных измерений позволяют значительно повысить классификационные свойства проточной цитометрии.

Комбинация элементов матрицы рассеяния, регистрируемая на сканирующем проточном цитометре выглядит следующим образом:
( S 11 Su S,3 s ) 14 f
S21 S22 s23 s24 cos(2<)
S„ s32 S33 S34 sin(2)
Al s42 S43 S44J с 0 ,
где S0

cos(2cp)
зіп(2ф)

(2.1.3)
- вектор Стокса линейно поляризованной волны с углом ср
между плоскостью поляризации и осью лабораторной системы координат, а в,/ = (100 0) — вектор Стокса для фотоприемника, регистрирующий излучение.
Интегрирование по углу ср, связано с функциональной особенностью сферического
зеркала.
После перемножения и интегрирования получаем выражение:
(2.1.4)
Т = Д511(е.ф) + 5,2(0,ф) соз(2ф) + S|3 (б, ф) зіп(2ф)|йф.
Элемент рассчитанный при помощи теории T-матриц для вытянутого сфероида вращения, при наличии угла между осью симметрии и направлением падающего излучения, в полярных углах рассеяния 10° - 60°, показан на Рис. 2.1 в сферических координатах (log(/s), 0, ф). Падающее излучение проходит через центр нижней грани и центр верхней грани координатного куба. Видно, что отклонение направления оси вращения от направления падающего излучения после интегрирования по азимутальному углу приведет к замыванию структуры индикатрисы.