Изучение индуцированного васкулогенеза в 3D культуре мультипотентных мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика

• Автор: Горкун, Анастасия Алексеевна
• Шифр специальности: 14.03.03, 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ГЛАВА 1. Ранние и поздние эндотелиальные прогениторы. ЗЭмодели васкуло и ангиогенеза т уИго. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Моделирование роста тубулоподобных структур в матригеле. Изучение поведения клеток сфероидов ММСК ПК в ткани печени крыс на модели хронической печеночной недостаточности. Исследование строения сфероидов. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ММСК ПК. Исследование строения сфероидов ММСК ПК. Инъекция васкуляризованных сфероидов ММСК ПК в поврежденную печень крыс при моделировании хронической печеночной недостаточности
4 x i i i i I . XI Ii i i i XXI г. Результаты диссертационного исследования используют для моделирования васкулогенеза и ангиогенеза i vi, подготовки клеток к трансплантации в поврежденные ткани, получения васкуляризованной микроткани для тканеинженерных конструкций в лаборатории клеточной биологии и патологии развития ФГБУ НИИОПП РАМН и для исследования регенеративного и иммуномодулирующего воздействия мезеносфероидов на печень при развивающемся патологическом процессе в лаборатории биотехнологии стволовых клеток ФГБУ ФНЦТИО им.


Разработать и стандартизовать методику серийного масштабирования жизнеспособных аваскулярных и васкуляризованных мезеносфероидов из стандартного сырья. Изучить динамику сфероидообразования ММСК ПК. Сравнить распределение экспрессии в и культуре эпителиальных и мезенхимных маркеров, оценить пролиферативный потенциал клеток сфероида, исследовать структурные изменения на клеточном и ультраструктурном уровне. Исследовать экспрессию маркеров ранних и поздних эндотелиальных прогениторных клеток в аваскулярных и васкуляризованных сфероидах ММСК ПК. Осуществить скрининг УЕвЕиндуцированных сфероидов ММСК ПК к капиллярогенезу в ЗОматригеле. Проверить возможность образования васкуляризованной микроткани при слиянии мезеносфероидов. ММСК ПК. Были впервые исследованы пластичность и перераспределение экспрессии мезенхимных и эпителиальных маркеров в клетках сфероидов ММСК ПК. Впервые были выявлены ранние ЭП в аваскулярных мезеносфероидах. Впервые показано, что УЕвК индуцировал появление в культуре ММСК ПК поздних ЭП, способных к образованию люменов внутри сфероида и тубулоподобиых структур в окружающем матриксе при помещении в матригель. Предложена оригинальная методика получения васкуляризованной микроткани путем слияния индуцированных мезеносфероидов с образованием единой капиллярной сети. Впервые показано, что трансплантированные в составе сфероида поздние ЭП выживали в поврежденной ксеногенной печени без иммуносупрессии, встраивались в стенки сосудов реципиента и сохраняли экспрессию маркера ЭП. ПК. Было показано, что клонированная культура ММСК ПК способна к сфероидообразованию с включением в новообразующийся сфероид практически всех клеток в системе. Предложенный метод позволяет получить максимально возможное количество идентичных мезеносфсроидов с минимальными потерями исходного числа клеток. Было установлено, что сфероидообразование ММСК К всегда сопровождается ламинацией сфероида на две функциональные зоны, ультраструктурными изменениями и перераспределением паттернов экспрессии мезенхимных и эпителиальных маркеров. Нестин, цитокератин эпителиоподобные клетки располагались на поверхности сфероидов, тогда как коллаген 1У округлые клетки были сосредоточены в центральной части, но все клетки сфероида сохраняли экспрессию виментина, цитокератина и ламииина. Были выявлены ранние и поздние ЭП в культуре ММСК ПК. Продемонстрирована новая клеточная модель васкулогенеза и ангиогенеза из одного типа клеток. Появление поздних ЭП было связано с влиянием УБОР и сопровождалось образованием люменов и тубулоподобных структур в матригеле. Установлено, что сфероиды ММСК ПК способны к неограниченному слиянию с увеличением плотности клеток в объединенном сфероиде. Слияние васкуляризованных сфероидов приводило к сегрегации С1 клеток с образованием единой капиллярной сети. Интеграция с тканями реципиента и сохранение экспрессии специфического маркера свидетельствовали о способности поздних ЭП из сфероидов ММСК ПК к участию в регенерации сосудистой сети поврежденной печени крыс. Разработанный метод получения васкуляризованных мезеносфероидов может найти применение в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Культивирование сфероидов ММСК ПК на агарозных планшетах позволяет с малыми трудозатратами получать из стандартного сырья большие достаточные для клинических трансплантаций количества сфероидов. ММСК ТТК при сфероидообразовании разделяются на две популяции нестинцитокератин и нестинколлаген IV клетки. Популяции отличаются не только иммуноцитохимическими, но и ультраструктурными особенностями. При 3 культивировании ММСК ПК происходит спонтанная диффсрснцировка в эндотелиальном направлении, сопровождающаяся новообразованием ранних ЭП. Добавление индукционного фактора V стимулирует появление поздних ЭП, формирующих люмены внутри сфероида и тубулоподобные структуры в матригеле. При слиянии большого числа сфероидов, в новообразованной ткани развивается внутренняя сосудистая сеть. Локальное введение васкуляризованных сфероидов в ткань поврежденной печени крыс приводит к интеграции поздних ЭП с тканями реципиента и их участию в регенерации сосудистой сети.