Изучение и моделирование новых фармакологических мишеней для лечения болезни Альцгеймера

• Автор: Середенина, Тамара Сергеевна
• Шифр специальности: 14.00.25, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Болезнь Альцгеймера

1.1.1. Определение БА

1.1.2. Этиология и патогенез БА

1.1.2.1. Амилоидная гипотеза

1.1.2.2. Холинергическая гипотеза.

1.1.3. Фармакотерапия БА.

1.1.3.1. Стратегии лечения БА.

1.1.3.2. Нейропротективное действие никотина

1.1.3.3. А1рЬа7пАСЬР как мишень фармакотерапии БА
1.2. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор типа альфа7
1.2.1. Семейство никотиновых ацетилхолиновых рецепторов
1.2.2. Характеристика арба7пАСР.
1.2.2.1. Ген и варианты альтернативного сплайсинга а1рЬа7пАСбВ.
1.2.2.2. Локализация и функция арпАСбР в головном мозге.
1.2.2.3. Локализация и функция арба7пАСЬВ в периферических органах
1.2.3. Биогенез никотиновых ацетилхолиновых рецепторов.
1.2.3.1. Клеточный аппарат, регулирующий биогенез пАСЗ.
1.2.3.2. Влияние типа клеток на экспрессию функционально активного ара7пАСЯ.
1.3. ИСЗ шаперон арба7пАСВ.
1.3.1. Структура ЕЗЮЗ
1.3.2. Локализация 3.
1.3.3. Функция ЕЗЮЗ
1.4. ВОМВ как мишень фармакотерапии болезни Альцгеймера
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Выделение РНК
2.2. Синтез кДНК
2.3. Стандартные методы молекулярной биологии.
2.4. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.5. Конструирование плазмидных векторов
2.6. Количественная риалтайм ПЦР.
2.7. Культивирование клеток.
2.8. Первичная культура нейронов
2.9. Транзиентные трансфекции.
2 Создание рекомбинантных клеточных линий.
2 Окрашивание флюоресцентным аВд1
2 Иммуноцитохимия.
2 ВЫРЕЗ анализ
21. Реагенты для РЫР теста.
22. Анализ данных ВЫРЕЗ теста
23. Оценка качества ВЫРЕЗ теста
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Клонирование и характеристика ЕС3.
3.1.1. Клонирование ЕЗЮЗ человека.
3.1.2. Идентификация нового варианта ИСЭ человека.
3.1.3. Экспрессия вариантов ЕЗЮЗ в тканях человека
3.1.4. Предсказание т эШсо и клонирование ЕЗЮЗ крысы
3.1.4.1. Идентификация i ii и характеристика I3 крысы.
3.1.4.2. Клонирование I3 крысы.
3.1.5. Идентификация и анализ структуры вариантов
альтернативного сплайсинга I3
3.1.6. Анализ экспрессии вариантов I3 в тканях и органах.
3.1.7. Количественный анализ экспрессии I3 и 7 в тканях и органах человека и крысы.
3.1.8. Субклеточная локализация и транспорт I3 крысы.
3.1.9. Влияние I3 на поверхностную экспрессию
7.
3.2. Создание и характеристика рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей функциональный 7 человека
3.2.1. Создание клеточной линии, экспрессирующей
7 человека и I3 человека
3.2.2. Фармакологическая характеристика клеток СНОК1, экспрессирующих рекомбинантный человеческий 7
3.3. Изучение влияния препарата семакс на уровень в мозге крысы
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Клонирование и характеристика I3.
4.2. Экспрессия транскриптов I3 и 7 в разных органах
4.3. Субклеточная локализация и функция I3
4.4. Создание и характеристика рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей функционально активный 7.
4.5. Влияние семакса на уровень в мозге крысы.
выводы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Настоящее исследование, выполненное в соответствии с планом международного научнотехнического сотрудничества между ГУ НИИ фармакологии имени В. В.Закусова РАМН и компанией ii Италия, посвящено изучению никотинового ацетилхолинового рецептора альфа 7 типа I7 и выяснению возможности регуляции содержания новым оригинальным препаратом семакс. 7 представляет собой ионный канал с высокой проницаемостью для ионов кальция. Наиболее высокие уровни экспрессии этого рецептора найдены в коре, гиппокампе, гипоталамусе и в миндалине i . Активация 7 опосредует нейропротекцию, что показано в опытах i vi с применением ряда токсических воздействий, включая i i, . В опытах i viv установлено, что стимуляция этого канала ведет к улучшению когнитивных функций . vi . Поэтому перспективным представляется создание клеточной модели 7 для скрининга и фармакологической характеристики возможных регуляторов рецептора. Однако в достижении цели возникает ряд проблем. В клеточных линиях не нейронального происхождения не удается получить функционально активный рецептор при гетерологической экспрессии 7 i, . Сборка и транспорт этого ионного канала являются недостаточно изученным процессом. Однако, как и другие ионные каналы , , он находится под контролем шаперонов эноплазматического ретикулума ЭР. Недавно был обнаружен новый белок, I3 i iii i, который оказался необходимым для экспрессии функционирующего 7 vi . Ьа7пАСР, в настоящей работе был использован ИЮЗ. Основными целями исследования, направленного на изучение новых фармакологических мишеней средств лечения БА, явилось создание клеточной модели функционально активного а1рЬа7пАСЬР и выяснение влияния нового ноотропного препарата семакс на содержание ЕШЦБ в мозге крыс. Клонировать полную кодирующую последовательность ИЮЗ человека и крысы для изучения консервативных участков и видовой специфики их структуры и функции. Идентифицировать и охарактеризовать варианты Я1С3 человека и крысы. Изучить экспрессию транскриптов ИСЗ в сравнении с экспрессией а1рЬа7пАС1зК в тканях и органах человека и крысы. Исследовать субклеточную локализацию ИЮЗ в разных типах клеток. Изучить функцию ШСЗ в процессе созревания а1рНа7пАС1пР. На основании полученных результатов создать и охарактеризовать с использованием фармакологических анализаторов рекомбинантную клеточную линию, экспрессирующую человеческий а1рба7пАСЬР в присутствии человеческого ИЮЗ. Фармакологически изучить влияние семакса на динамику содержания ЕЮЫБ в структурах головного мозга крысы. Создана рекомбинантная клеточная линия СНОК1, экспрессирующая функционально активный человеческий а1рЬа7пАСб3 в присутствии человеческого 1С3. Впервые клонирована полная кодирующая последовательность ДНК ЗЮЗ крысы и новый вариант сплайсинга С3 человека, 030. Полиморфизм 5ег38ег3, уже описанный для ЗЮЗ человека, подтвержден для ЗЮЗ крысы. Впервые получены данные о распределении транскриптов 1С3 и а1рба7пАСЫЗ в отделах мозга и в периферических тканях и органах человека и крысы. Описана субклеточная локализация 1С3 в первичной культуре нейронов коры крысы. Установленные данные показали, что полиморфизм ЗЮЗ Э8 не важен для транзиентной экспрессии а1р1а7пАСЬ3 в клетках СНОК1. Доказана способность человеческого 1С3 обеспечивать стабильную гетерологическую экспрессию функционально активного человеческого а1рЬа7пАС3 в клетках СНОК1. Установлено, что препарат семакс в дозах и 0 мкгкг увеличивает уровень белка ВМР в гиппокампе и в базальных ядрах крысы через 3 часа после интраназального введения. Созданная рекомбинантная клеточная линия СНОК1, экспрессирующая функционально активный человеческий а1рЬа7пАСбН в присутствии ЗЮЗ, является новой экспериментальной моделью, дающей возможность проведения фундаментальных исследований сборки, транспорта и регуляции рецептора.