Роль трасформирующего ростового фактора (TGF)b в прогрессии гепатокарцином

• Автор: Макарова, Мария Викторовна
• Шифр специальности: 14.00.14
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : 30 ил.

Введение

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая ценность работы

1. Обзор литературы

1.1. Канцерогенез

1.2. Трансформирующий фактор роста 3

1.2.1. Процессинг и активация ТвРр

1.2.2. Рецепторы и адаптерные молекулы кТСБр

1.2.3. Бтас зависимый контроль транскрипции

1.2.3.1. Бтас белки

1.2.3.2. Взаимодействие белков Бтас с ДНК

1.2.4. Альтернативные сигнальные пути
1.3. ГСРр как опухолевый супрессор
1.3.1. Мутации генов, кодирующих компоненты ГСРР сигнального пути в опухолях человека
1.3.2. Модельные системы канцерогенеза, в которых показана супрессорная роль ТОБЗ
1.3.3. Механизмы противоопухолевого действия ТСРЗ
1.3.3.1. Арест клеточного цикла
1.3.3.2. Индукция апоптоза
1.4. Проопухолевые эффекты ТСБР
1.4.1. Гиперэкспрессия ТОБр в опухолях человека
1.4.2. Механизмы проопухолевого действия ТвРр
1.4.2.1. Ускорение пролиферации
1.4.2.2. ТвРр зависимое уклонение от программы апоптоза
1.4.2.3. ТвБР индуцирует эпителиальномезенхимальный переход
1.4.2.4. Влияние ТвБр на способность опухолевых клеток к инвазии
1.4.2.5. Действие на микроокружение опухоли
1.4.2.6. Регуляция ангиогенеза в опухолях
1.4.2.7. Модуляция иммунного ответа
1.5. Гепатоканцсрогенез
1.5.1. Тканеспсцифические транскрипционные факторы
1.5.2.Нарушение функции ГЯФ при геиатоканцерогепезе
1.5.3.Модель одноступенчатой прогрессии ГК мыши
2. Материалы и методы
2.1. Список использованных растворов и сред
2.2. Клеточные линии
2.2.1. Эукариотические клеточные линии
2.2.2. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы
2.3. Трансформация клеток Е. СоН
2.4.1. Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК
2.4.2. Выделение суммарной клеточной РНК
2.5. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях
2.6. Метод обратная транскрипцияполимеразная цепная реакция ОТПЦР
2.6.1. Подбор и синтез оли го нуклеотидных праймеров
2.6.2. Полимеразная цепная реакция ПЦР е обратной транскрипцией ОТ
2.7. Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов
2.8. Весгсрнблот гибридизация
2.9. Трансфекция и инфекция клеток линии 2
2 Трансфекция и инфекция клеток линии НЗЗ
2 Определение количества в культуральной среде
2 Анализ активности репортерного гена люциферазы
2 Измерение скорости роста клеточных линий iI2 и НЗЗ
. Определение включения модифицированного нуклеотида в ДНК
. Измерение кинетики роста клеточных линий i vi
. Клоногенный тест
пределснис способности к инвазии и подвижности клеток
3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Изучение ТвРЗиндуцируемых эффектов в клеточной линии 2
3.1.1. Анализ экспрессии генов, ассоциированных с прогрессией ГК, и генов, ответственных за поддержание дифференцированног о статуса гепатоцитов, при обработке клеточной линии 2 цитокинами.ТОГр1 и 2
3.1.2. Изменение экспрессии изоформ 4 и при ингибировании передачи сигнала от рецептора
3.1.3. Активация сигнального каскада в клеточной линии 2 под действием 2
3.1.4. Изменение экспрессии изоформ 4 и при ингибировании МЕК сигнального пути
3.1.5. Анализ экспрессии генов в клеточной линии 2, гиперэкспрессирующсй
3.1.6. Изменение пролиферативных характеристик клеточной линии. 2 при гипсрэкспрессии 2
3.1.7. Анализ активности зависимого сигнального каскада при гиперэкспрессин в кулыуре гепатомы 2
3.2. Изучение эффектов, вызванных подавлением продукции.2 в клеточной линии НЗЗ
3.2.1. Подавление продукции 2 в клеточной линии НЗЗ
3.2.2. Анализ экспрессии генов в клеточной линии НЗЗ, трансфицированной миРНК к
3.2.3. Изменение скорости пролиферации культуры клеток НЗЗ при подавлении продукции
3.2.4. Исследование подвижности и инвазии клеток НЗЗ при подавлении пдvкцн
3.2.5. Анализ функциональной активности белков в культуре клеток НЗЗ
Заключение
Выводы
Список литературы


Канцерогенез представляет собой сложный многостадийный процесс, в результате которого происходит клональная экспансия клеток. В процессе трансформации. Постоянная селекция, которая происходит под давлением со стороны организма, дает возможность выжить в популяции такого клона все более автономным и агрессивным субклонам Заридзе, . В настоящее время признано, что процесс химически индуцированного канцерогенеза включает три основных этапа инициацию, промоцию и прогрессию опухоли i , . Первые этапы канцерогенеза связаны с инициацией образования опухоли. Эта стадия характеризуется необратимостью и происходит при воздействии канцерогена или спонтанных изменениях в клетке, приводящих к мутациямотдельных генов. Группы инициированных клеток получили название пренсопластических фокусов или,узелков. В нормальной ткани такие. Следующей стадией канцерогенеза является промоция. В этот период в клетке происходят существенные изменения метаболизма и активности генов, способствующих трансформации. Эта стадия обратима при отмене промотора возможна регрессия Промоторное действие оказывают вещества, изменяющие характер экспрессиигенови способные индуцировать пролиферацию При этом в клетке появляются белки, несвойственные для данной ткани или стадии дифференцировкн. Стадия промоции сопровождается морфологическими изменениями деконденсацией хроматина, разрушением межклеточных контактов и отделением клеток друг от друга. Стадия промоции завершается либо полным исчезновением гиперплазии,либо образованием опухоли, дальнейшее развитие которой происходит за счет прогрессии. Прогрессией называется процесс постепенного приобретения опухолью все более автономного и агрессивного характера роста. Эта стадия необратима, так как для не характерна растущая нестабильность генома, приводящая к анеуплоидиям и другим хромосомным аберрациям. В процессе изучения механизмов трансформации клеток и прогрессии опухолей различного происхождения было получено множество данных, выявлено громадное количество мутаций в различных генах, ведущих к перерождению нормальной клетки в опухолевую i, . Все это позволило выделить ряд важнейших свойств опухолевых клеток Рис. Опухолевые клетки независимы от экзогенных пролиферативных стимулов, так как многие онкогены кодируют факторы роста или участвуют во внутриклеточной передаче митогенного сигнала. Опухолевые клетки также приобретают способность уклоняться от апоптоза запрограммированной смерти. Три перечисленных выше свойства, приобретаемых при трансформации, дают клетке возможность не зависеть от внешнего микроокружения. В принципе, приобретение этих свойств способствует образованию популяции постоянно пролиферирующих клеток, в результате чего может развиться опухоль. К необходимым изменениям относятся также появление теломеразной активности, в результате которой клетка обретает способность делиться неограниченное количество раз, и ангиогенез, способствующий разрастанию опухоли. Приобретение всех вышеперечисленных свойств в процессе канцерогенеза так или иначе может осуществляться посредством изменений в геноме опухолевой клетки. Но возникновение мутаций во вполне определенных генах событие, в общемто, редкое, так как в нормальной клетке функционирует большое количество систем мониторинга ДНК повреждений и их репарации. Генетическая нестабильность вместе с постоянно идущим отбором в опухолевых клетках способствует накоплению и закреплению в ряду клеточных поколений нескольких мутаций в онкогенах, опухолевых супрессорах и других генах, придающих клетке совокупность необходимых доя образования опухоли свойств. Генетическая нестабильность достигается за счет неточности репликации ДНК и сегрегации хромосом во время митоза, нарушения репарации повреждений ДНК или ошибок, возникших при репликации, ослабления функции чеклоинтов клеточного цикла, активируемых в ответ на повреждения структуры ДНК, а также за счет ослабления индукции апоптоза, вследствие чего делящиеся клетки с генетическими нарушениями не погибают, а выживают i, . Рисунок 1.