Разработка ускоренных способов ДНК-диагностики для определения бактерий в мясе и мясопродуктах

• Автор: Мамаев, Максим Александрович
• Шифр специальности: 16.00.08
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Бактериологический анализ мяса и мясопродуктов при ветеринарносанитарной экспертизе и сертификации.
1.2. Сравнительная оценка методов ДНКдиагностики при индикации и идентификации микроорганизмов.

1.2.1. Гибридизация нуклеиновых кислот

1.2.2. Амплификация генов.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Цель и задачи исследований

2.2.Объекты и методы исследований.

2.2.1 .Объекты исследований

2.2.2.Методика бактериологического анализа мяса и мясопродуктов.
2.2.3.Контаминация мяса и мясопродуктов микроорганизмами
2.2.4.Выделение и очистка тотальных ДНК для идентификации бактерий
2.2.5.Выделение и очистка ДНК с использованием гуанидинтиоизоционата
2.2.6. Мечение тритием бактериальных ДНК методом никтрансляции
2.2.7.Мечение биотином бактериальных ДНК методом никтрансляции
2.2.8. Мечение ДНК методом рассеянной затравки
2.2.9. Получение меченых ДНКзондов с помощью полимеразной цепной реакции.
2.2ДНК гибридизация на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах с реперными, ДНК меченными тритием
2.2 Точечная ДНК гибридизация на мембранных фильтрах с биотинилированными ДНК
2.2 ДНК гибридизация с использованием тестнабора с ДНКзондами, меченными биотином
2.2 Методика полимеразной цепной реакции
2.2 Статистическая обработка результатов
2.3. Результаты исследований
2.3.1.Разработка модификации метода ускоренной идентификации бактерий на основе гомологии тотальных ДНК, меченных биотином.
2.3.2. Усовершенствование способа ускоренной индикации энтеробактерий в мясе и мясопродуктах на основе ДНКзондов с возможностью дифференциации токсигенных форм
2.3.3.Разработка модификации метода количественного определения бактерий, в мясе и мясопродуктах на основе ПЦР с мечеными дезоксинуклеозидтрифосфатами
2.3.4. Сравнительная оценка результатов индикации и идентификации бактерий в мясе и мясопродуктах полученных, с помощью разработанных и
общепринятых методов
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
ВЫВОДЫ
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


При сертификации мяса и мясных продуктов в системе сертификации ГОСТ Р основным нормативным документом, определяющим показатели безопасности, являются Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Санитарные правила и нормы. СанПиН 2. За рубежом контроль качества мяса и мясных продуктов осуществляется в рамках различных систем сертификации. Международной организацией по стандартизации ИСО и Европейской организацией по контролю качества ЕОКК разрабатываются международные и европейские стандарты, унифицированные документы и различного рода рекомендации. Комиссия Кодекс Алиментариус является международным органом, ответственным за выполнение программы стандартов на пищевые продукты, включая мясо и мясопродукты. ООН по вопросам продовольствия и сельского хозяйства ФАО и Всемирной организацией здравоохранения ВОЗ. Согласно международным
стандартам, исследования по ветеринарносанитарной экспертизе мяса должны применяться на каждой ступени производства, начиная с ферм. Ответственность за безопасность и качество произведенного мяса разделяется между производителем и контролирующими органами. Микробиологические критерии традиционно являются одними из главных показателей безопасности пищевых продуктов. Международные стандарты по микробиологической оценке пищевых продуктов включают различные вопросы микробиологического контроля, в том числе определение спектра идентифицируемых микроорганизмов и их количественные характеристики I , , . Несмотря на гармонизацию критериев оценки мяса и мясопродуктов в разных странах, существуют специфические подходы, связанные с экологическими и национальными особенностями. Кроме того, различные системы добровольной сертификации в одной стране могут включать дополнительные критерии микробиологических показателей как в плане спектра определяемых возбудителей, так и их количественной оценки. Согласно санитарным правилам и нормам СанПиН 2. Эти возбудители относятся к семейству i и к родам и ii. Сальмонеллы вызывают первичные инфекции у животных и человека, нередко сопровождающиеся смертельным исходом. Они чаще локализуютя в печени, кишечнике, лимфатических узлах. Для выявления бактерий рода производят посев на дифференциальнодиагностические среды i . Дифференциация сальмонелл от кишечной палочки основана на способности последних ферментировать лактозу. На среде Эндо кишечная палочка, разлагая лактозу до молочной кислоты, восстанавливает обесцвеченный сульфидом натрия фуксин, образуя колонии красного цвета с металлическим блеском. На среде Левина эшерихии образуют синие или
чрные колонии, на среде Плоскирева розовые. Сальмонеллы лактозу не ферментируют, поэтому на указанных средах образуют бесцветные колонии ГОСТ 5 Голубева, . Сальмонеллы грамотрицательные, не образующие спор и капсул бактерии, представляющие собой палочки с закруглнными концами, длиной мкм, шириной 0,,8 мкм. В большинстве свом они подвижны, оптимальная реакция среды слабо щелочная 7,,4, температура С. Сальмонеллы имеют сложную антигенную структуру О, Н, М, К, и VI антигены. Антигенная структура сальмонелл подвержена изменчивости и вариации при переходе из ь в гформу, а также в результате трансдукции, лизогенной конверсии и коныогации Голубева, Поляков, Кисленко,
Для серологической типизации выделяемых штаммов сальмонелл используют групповые и видовые агглютинирующие сыворотки. Для полной типизации выделенной культуры с пересевают на разврнутый пстрый ряд, включающий бульон Штерна, среду с рамнозой, лакмусовое молоко, среды с арабинозой, салицином, дульцитом и другими углеводами Краснобаев и др. Голубева, . Показана возможность индикации сальмонелл бактериофагами и различными иммунологическими тестсистемами Серегин и др. Бровкина, МиоМ, . Таким образом, индикация сальмонелл представляет достаточно сложную процедуру, и е упрощение и совершенствование является необходимой задачей ветеринарносанитарной экспертизы. Другие бактерии, контаминирующие мясо и мясопродукты, в основном относятся к группе кишечной палочки. Эшерихии вызывают у животных и человека кишечные инфекции, а также менингит, сепсис, энцефалит, пиелонефрит, цистит, мастит и др.