Разработка тест-систем и технических средств ускоренной оценки безопасности и качества объектов ветеринарно-санитарного контроля

• Автор: Светличкин, Вячеслав Владимирович
• Шифр специальности: 16.00.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 350 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТ УРЫ.

ГЛАВА 1. Современное состояние оценки безопасности и качества объектов ветеринарносанитарного контроля

Критерии и методы оценки безопасности и качества

животноводческих производств и продукции.

Микробные контаминации и их оценка.

Идентификация продукции и определение

фальсифицирующих примесей

Методы генной диагностики и их роль в оценке безопасности

и качества объектов ветеринарносанитарного контроля

Автоматизированные системы и приборы контроля качества и
безопасности.
ДНКмикрочиповая технология
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ .
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований
Микробиологические методы исследований
Методы бактериологического анализа эшерихий, сальмонелл,
стафилококков.
Определение чувствительности бактерий к действию
антибиотиков
Метод выращивания бактерий в полужидком агаре на
мембранных фильтрах.
Получение и определение Ьформ бактерий.
Электронномикросколические исследования.
Методы ДНКдиагностики III
2.3.1. Выделение и очистка ДНК бактерий.
2.3.2. Выделение и очистка ДНК из тканей животных.
2.3.3. Включение тритиевой метки в ДНК методом никтрансляции
2.3.4. Включение биотиновой метки в ДНК методом никтрансляции
2.3.5. Включение метки в ДНК методов рассеяной затравки
2.3.6. Получение меченых ДНКзондов с помощью полимеразной цепной реакции.
2.3.7. Точечная ДНКгибридизация с биотиновой меткой
2.3.8. Гибридизация ДНК с тритиевой меткой
2.3.9. ДНКгибридизация с использованием тестнабора с ДНК
зондами меченными биотином.
2.3 Методика гибридизации колоний
2.3 Методика полимеразной цепной реакции.
2.4. Методика иммудиффузии в геле.
2.5. Статистическая обработка результатов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 3. Разработка методов и тестсистем индикации и идентификации микроорганизмов в объектах ветеринарносанитарного контроля на основе ДНКдиагностики.
3.1. Идентификация бактерий в объектах ветеринарносанитарного и экологического контроля на основе гомологии нуклеиновых кислот методом гибридизации колоний
.2. Разработка модификации метода ускоренной идентификации
бактерий на основе гомологии ДНК меченной биотином
3.3. Разработка тестсистем индикации бактерий с
использованием генных зондов.
3.4. Разработка метода дифференциального определения
вегетативных и Ьформ бактерий в объектах ветеринарносанитарного контроля с использованием ДНКгибридизации
на мембранных фильтрах.
Индикация бактерий в объектах ветеринарносанитарного контроля на основе ПЦР с меченными
дезоксинуклеозидтрифосфатами
ГЛАВА 4. Разработка методов и тестсистем идентификации
видовой принадлежности мяса и мясопродуктов.
Разработка методов и тестсистем идентификации говядины
на основе ДНКдиагностики
Разработка тестсистемы определения видовой
принадлежности мяса и субпродуктов на основе
иммунодиффузии в геле
ГЛАВА 5. Приборная реализация ускоренных методов оценки
безопасности качества.
Разработка автоматизированных систем на основе ДНК
диагностики.
Разработка тестсистем и технических средств для проведения
анализа в нестационарных условиях.
ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Общими свойствами протопластов и сферопластов является их способность к неравновеликому делению и почкованию. Они широко распространены как в природе, так и в организме животных и человека, однако их выделение затруднено, так как они имеют либо дефектность клеточной стенки, либо ее полное отсутствие, в результате чего не окрашиваются и не выявляются методами световой микроскопии Прозоровский С. В.,, Тимаков В. Д.,, ,, i . Для форм характерны колонии, врастающие в питательный субстрат, способные проходить через бактериальные фильтры благодаря особым способам репродукции. Изменение характера роста и обменных процессов по сравнению с исходными формами, способность к стабилизации и другие признаки, существенно отличают формы от всех других групп микроорганизмов Шлегель Г. Гетероморфиые формы, сферопласты и протопласты могут являться потенциальными предшественниками форм, т. Различают нестабильные формы, легко реверсирующие в отсутствие трансформирующего фактора и являющиеся выражением фенотипических изменений бактерий, и стабильные формы, утратившие способность к реверсии и наследственно закрепленные. Из нестабильных форм выделяют условностабильные. Они отличаются отсутствием способности к реверсии при пассировании на средах без трансформирующего агента. Могут реверсировать при дополнительных изменениях условий культивирования Билич ГЛ. Габрилович И. М.,
Стент Г. Шапиро Джеймс А. В.,. Как стабильные, так и нестабильные формы характеризуются значительным полиморфизмом, независимо от фазы развития и условий культивирования. Павлова И. Б.,, ,. Различия в структуре клеточной стенки стабильных и нестабильных форм особенно наглядны у форм грамотрицательных бактерий. Изменения бактериальной клетки при трансформации не исчерпываются клеточной стенкой и мембранным аппаратом. Эти изменения на поздних стадиях трансформации затрагивают и генетический аппарат клетки. Существует также явление спонтанной трансформации бактерий, которое представляет собой естественную, генетически запрограммированную форму развития популяции, скорость и степень проявления которой определяются условиями среды обитания Гинцбург А. Л., Романова Ю. М.,, Прозоровский С. В., и др. I ,, М. Приведенные данные, касающиеся полиморфизма форм, архитектоники колоний и взаимоотношения между отдельными клетками внутри колонии, показали перспективность дальнейшего исследования бактерий на популяционном уровне Павлова И. Б.,, Т. М., , i . Колония это популяция микроорганизмов, полученная из одной клетки. В процессе развития колонии возникают измененные формы в результате мутаций отдельных генов или в результате перестройки
генетического материала. Изменчивость состава популяции отражает процессы микроэволюции. К такого рода явлениям относится, прежде всего, так называемая диссоциация бактерий . Диссоциация бактерий постоянный процесс и потому легко обнаруживается изменчивость внешнего вида колоний, причем одновременно с этими изменениями нарушается и целый ряд других свойств клетки. Изменчивость такого рода может иметь большое значение для выживания бактерий, а также представляет большой практический интерес, поскольку в процессе диссоциации происходит изменение степени вирулентности патогенных бактерий, интенсивность синтеза биологических активных соединений соответствующими продуцентами и т. Билич Г. Л., Габрилович И. М.,. Ьшероховатые или складчатые. Диссоциация отличается от случайных мутаций высокой частотой возникновения вариантов и их взаимных переходов. Частота переходов характерна для определенных штаммов, т. Сассон А. Диссоциацию наблюдали, прежде всего, у патогенных бактерий. Особое внимание этот процесс привлекает потому, что с изменением характера колоний связано изменение вирулентности и антигенных свойств микроорганизмов Милько Е. С., Егоров Н. С.,, Николаев Ю. А., Воронина , , i . I ,, ii . В колониях вариантов бактерии имеют частично редуцированную полисахаридную часть липополисахарида внешней мембраны клеточной стенки, следовательно клетки более гидрофобны. Также часто образуются инволюционные клетки, т.