Усовершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины против блютанга

• Автор: Сливко, Вероника Владимировна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 148 с. : ил

Оглавление

3.1 Материалы и методы

3.1.1 Вирус.

3.1.2 Культуры клеток.

3.1.3 Питательные среды, растворы и сыворотки.

3.1.4 Реактивы

3.1.5 Оборудование

3.1.6 Животные

3.1.7 Выращивание перевиваемых линий клеток.

3.1.8 Культивирование вируса блютанга в перевиваемых культурах клеток

3.1.9 Определение инфекционной активности вируса

3.1. Инактивация вируса блютанга
3.1. Определение полноты инактивации вируса.
3.1. Приготовление масляного адъюванта
3.1. Приготовление образцов инактивированной вакцины
3.1. Постановка сэндвич метода ТФ ИФА на основе МА для обнаружения антигена
3.1. Оценка иммуногенности образцов вакцины.
3.11 Постановка варианта двухфазного ингибирования ТФ ИФА на
основе МА для обнаружения специфических антител.
3.1. Выделение РНК и синтез к ДНК.
3.1. Постановка ПЦР.
3.1. Статистическая обработка результатов исследований
3.2 Результаты собственных исследований.
3.2.1 Обоснование выбора серотипов вируса блютанга при разработке
средств специфической иммунопрофилактики этой болезни.
3.2.2 Выбор технологически перспективной клеточной культуры для
выращивания вируса блютанга.
3.2.3 Разработка производственной технологии культивирования вируса
Оглавление
3.2.3 Л Определение оптимальной множественности
заражения.
3.2.3.2 Влияние концентрации сыворотки крови КРС в поддерживающей среде на накопление вируса блютанга.
3.2.3.3 Определение оптимального способа заражения культуры клеток
3.2.3.4 Накопление вируса в зависимости от величины концентрации водородных ионов .
3.2.3.5 Сравнение эффективности питательных сред Игла МЕМ разных фирмпроизводителей по их влиянию на накопление вируса блютанга в культуре клеток.
3.2.4 Методы культивирования вируса.
3.2.5 Усовершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины.
3.2.5.1 Выбор инактиванта.
3.2.5.2 Использование ПЦР для оценки полноты инактивации вируса блютанга
3.2.5.3 Выбор формы вакцинного препарата и изучение иммуногенности экспериментальных серий инактивированных вакцин.
3.2.5.4 Оценка антигеной активности вирусного сырья и образцов инактивированных вакцин сэндвич методом ТФ ИФА
3.2.6 Динамика образования вируснейтрализующих антител и длительность иммунитета при иммунизации овец инактивированной вакциной.
3.2.7 Определение иммуногенности образцов вакцины в процессе хранения
3.2.8 Методы контроля антигенной активности вирусного сырья и инактивированных препаратов.
3.2.9 Депонирование вируса блютанга.
3.2. Испытания инактивированной вакцины против блютанга.
3.2. Приготовление опытнопромышленной серии инактивированной вакцины против блютанга культуральной эмульгированной и ее испытания
Оглавление
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
5. ВЫВОДЫ.
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
8. ПРИЛОЖЕНИЯ.ОШИБКА ЗАКЛАДКА НЕ ОПРЕДЕЛЕНА.
Список сокращений
Список сокращений
Ат антитела
БСА бычий сывороточный альбумин
ВБ вирус блютанга
ВНИИВВнМ Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микро
биологии
ВНИИЗЖ Всероссийский НИИ защиты животных
ВГНКИ Всероссийский государственный НИИ контроля, стандар
тизации и сертификации ветеринарных препаратов
ВИЭВ Всероссийский институт экспериментальной ветерина
ВНИТИБП Всероссийский научноисследовательский и технологический институт биологической промышленности
ВКПВ высококонцентрированный полуфабрикат вируса
ВН вируснейтрализующие
ВНА вируснейтрализующие антитела
ГА глютаровый альдегид
ГЛА гидролизат лактальбумина
ГНУ государственное научное учреждение
ГОА гидроокись алюминия
ДЭИ димер этиленимина
ЗФР забуференный физиологический раствор 7,,
ЗФР Т забуференный физиологический раствор 7,,4, со
держащий 0, Туееп
ЗФРТБСА забуференный физиологический раствор 7,,4, содер
жащий 0, Туееп и 1 БСА кДа килодальтон
кл клетки
КЗ контрольное заражение
Список сокращений
КРС крупный рогатый скот
МА моноклональные антитела
МН микроносители
нтд нормативнотехническая документация
ППК6 монослойносуспензионная клональная сублиния переви
ваемых клеток почки эмбриона свиньи
ПО почка овцы
ПС почка свиньи
ПСГК почка сибирского горного козерога
ПСГКС, почка сибирского горного козерогасуспензионная
ПЦР полимеразная цепная реакция
РСК реакция связывания комплемента
реакция нейтрализации
РНК рибонуклеиновая кислота
ТФ ИФА твердофазный иммуноферментный анализ
ТУ технические условия
тцц тканевая цитопатическая доза
ФГМС ферментативный гидролизат мышечных белковсухой
ФГУ федеральное государственное учреждение
ЦПД цитопатогенное действие вируса
ЭГБО эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей
диаммониевая соль 2,2азиноби3этилбенздиазолин
сульфоновой кислоты.
Введение


Были разработаны и испытаны моно и поливалентные вакцины, полученные на основе живых атгенуированных штаммов этого возбудителя . Введение
носчиков конструирование вирусвакцин было ограниченным. Поэтому основные исследования были направлены на разработку эффективных монои поливалентных инактивированных культуральных вакцин. Инактивированная ДЭИ сорбированная вакцина против блютанга овец была разработана в бывшем СССР во ВНИИВВиМ В. А. Сергеевым, Н. П. АнаньевойРященко, и Р. В. Кошелевой в г. В г. И.Ф. Вишняковым, В. И. Жестеревым, М. Б. Новиковой и др. А ТУ Х 6. Однако, антигенная активность вирусного сырья, изготовленного из некоторых серотипов вируса блютанга, после инактивации значительно снижалась а вакцины, полученные на его основе, имели низкую иммуногенность. Это указывает на необходимость совершенствования технологии изготовления инактивированной вакцины против этой болезни. Учитывая, что в последние годы в странах, имеющих тесные экономические контакты с Россией Турция, Болгария, Югославия и др. Целью данной работы являлось усовершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины против блютанга. Введение
тивную перепиваемую культуру клеток, обеспечивающую максимальный уровень репродукции вируса. Разработать технологию получения вирусного сырья с использованием перевиваемых клеточных систем и технических приемов выращивания вируса блютанга различных серотипов стационарный, роллерный, на микроносителях, в суспензии. Провести сравнительную оценку эффективности инактивантов А, ДЭИ, Си4 и адъювантов масляный и ГОА по иммуногенности готовых вакцинных препаратов. Изучить биологические свойства производственных штаммов вируса блютанга 4, 9 и серотипов, используемых при изготовлении инактивированной вакцины, с целью их депонирования в коллекции микроорганизмов ВГНКИ. Разработать технологию изготовления бивалентной инактивированной вакцины против блютанга 4 и 9 серотипов. Изготовить и испытать на животных экспериментальные серии инактивированной моно и бивалентной вакцины против блютанга 4, 9, серотипов. Экспериментально оценены культуральные, вирусрепродуцирующие и технологические характеристики перевиваемых клеточных культур ПСГК, ПСГКС и ВНК и научно обоснованы перспективы их использования для получения вируса блютанга с целью изготовления инактивированной вакцины. Усовершенствована технология изготовления инактивированной вакцины против блютанга с использованием высокопродуктивных и экономически перспективных методов выращивания вируса 6,,5 ТЦДСМ3 в суспензии, на микроносителях и роллерного культивирования в клетках ПСГК, ПСГКС и ВНК. Введение
3. Предложены новые технологичные режимы инактивации вируса и принципы конструирования инактивированных вакцин с масляным адъювантом против блютанга в моно и бивалентных вариантах , 4 и 9 серотипы соответственно. Предложен метод иммунобиологической оценки инактивированной вакцины против блютанга по антигенной и иммуногенной активности в ТФ ИФА, и на морских свинках. Усовершенствована технология изготовления инактивированной вакцины против блютанга, заключающаяся в выборе универсальных взаимозаменяемых перевиваемых культур клеток для выращивания вируса различных серотипов ВНК, ПСГК, ПСГКС, использовании инактиванта А в концентрации 0, и применении нового масляного адъюванта. Разработана безвредная и иммуногенная бивалентная инактивированная вакцина против блютанга 4го и 9го серотипов, которая рекомендована для профилактики этой болезни у животных. Депонированы в коллекции микроорганизмов ВГНКИ производственные штаммы вируса блютанга 4, 9 и серотипов, используемые при производстве инактивированной вакцины. Разработана Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против блютанга поливалентной инактивированной, которая одобрена ученым советом, утверждена директором ВНИИВВиМ. I. Высокоэффективная технология получения культурального вируса блютанга различных серотипов с использованием универсальных взаимозаменяемых перевиваемых клеточных культур и современных технических приемов культивирования суспензионный, роллерный, на микроносителях.