Серологическая диагностика вирусного энтерита гусей методом иммуноферментного анализа

• Автор: Маслов, Дмитрий Владимирович
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 132 с.

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарной вирусологии

2.2 Краткие исторические данные, распространение вирусного энтерита парвовирусной инфекции гусей и ущерб, причиняемый этим заболеванием.

2.3 Характеристика семейства парвовирусов

2.4 Эпизоотологические данные болезни

2.5 Клиникопатоморфологические признаки.

2.6 Диагностика заболевания

2.7 Профилактика и меры борьбы.

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1 Материалы и методы.

3.1.1 Очистка вируссодержащей жидкости методом гельхроматографин на макропористом стекле .
3.1.2 Выделение иммуноглобулинов
3.1.3 Получение иммунопероксидазного конъюгата
3.2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.2.1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного анализа
3.2.1.1 Получение очищенного вируса энтерита гусей
3.2.1.2 Получение положительной сыворотки крови к вирусу энтерита гусей
3.2.1.3 Получение отрицательной сыворотки крови гусей
3.2.1.4 Получение антивидового иммунопероксидазного конъюгата.
3.2.2 Разработка иммуноферментной тестсистемы для выявления
специфических антител к парвовирусу гусей.
3.2.2.1 Определение сенсибилизирующих доз антигена.
3.2.2.2 Определение сорбирующего буфера.
3.2.2.3 Определение времени и температуры сорбции парвовирусного антигена
3.2.2.4 Определение времени и температуры инкубации сывороток с адсорбированным парвовирусным антигеном
3.2.2.5 Определение специфичности иммуноферментного анализа
3.2.2.6 Определение диагностического титра сыворотки в ИФА.
3.2.2.7 Количественная оценка титра антител к вирусу энтерита гусей методом одного разведения
3.2.3 Практическое использование разработанной тест системы на основе непрямого метода ИФА.
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
5 ВЫВОДЫ
6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИЛОЖЕНИЕ

1 Введение
Гусеводство, как любая отрасль птицеводства является резервом ускоренного увеличения производства мяса. Кроме того, развитие его оправдано тем, что гусиное мясо, отличаясь по вкусовым качествам от мяса других видов птиц, расширяет ассортимент мясных продуктов. Мясо молодых, 2месячного возраста гусятбройлеров известно, как ценный диетический продукт питания, а гусиная печень, получаемая при откорме специальных пород гусей вишнитес, рейнских и др., относится к деликатесам. Гусиный жир используется в парфюмерной и фармацевтической промышленности, а пух и перо являются ценным сырьем для легкой промышленности.
Актуальность


Растворы субстратов готовят непосредственно перед употреблением спонтанное окисление субстрата в растворе, в том числе и в присутствии перекиси водорода, может быть замедлено добавлением полиэтиленгликоля или другого водорастворимого полимера , . Стабилизация водных растворов 3,3, 5,5тетраметилбензидина достигается добавлением метилпирролидона , , . Удобны в работе водорастворимые апкилсульфонаты тетраметилбензидина , , . Фенолы и М,Идиалкиламины применяются обычно в составе двухкомпонентных субстратных смесей вторым компонентом являются соединения с первичными ароматическими аминогруппами. В результате такого окисления образуются красители хинониминового ряда. Типичными аминами являются 4аминоантипирин, м или п замещенные анилины , ii, , , , , 3амино9этилкарбозол , . Отличается особенно быстрое развитие окраски при применении 4йодфенола , . Преимущества одних комбинаций реагентов перед другими могут состоять в стабильности при
хранении растворов или сухих составов, в скорости развития окраски, се интенсивности и стабильности во времени после остановки реакции. Ы,Ыдиалкиланилины, содержащие в алкильной цепи карбоксильную , , или фосфатную группу . Для повышения стабильности конъюгатов пероксидазы при лиофильной сушке, хранении и стоянии в растворе очень часто авторы используют различные добавки , , , , i, i, i, i, , i, , , . Так, рекомендовано включение в композиции ионов алюминия, магния, цинка , , , солей кальция , , i, i, , полиэтиленгликоля i, i, , антибиотиков i, . Щелочная фосфатаза и ее конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако недостатком является относительно высокая стоимость фермента. В последнее время разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы . Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт ЫАД определяется в ферментативной системе регенерации кофактора А. М. Егоров с соавт. Такого рода подходы для определения щелочной фосфатазы являются весьма перспективными в плане создания на их основе сверхчувствительных методов ИФА. Дгалактозидаза также широко используется в ИФА. Из других ферментов, предлагавшихся в последние годы для твердофазного иммуноанализа, заслуживают упоминания ацетилхолинэстераза электрического угря i, , , аамилаза i, , , пирофосфатаза из . Байков с соавт. Анализ
литературных данных показывает, что многие зарубежные фирмы в создании усовершенствованных методов твердофазного иммуноанализа идут по пути поиска новых ферментов. Представляется, однако, маловероятным, что поиск новых ферментов приведет к существенному повышению чувствительности анализа. Более перспективны, вероятно, пути увеличения количества связанного фермента в конъюгате или применения комбинаций ферментов так называемый метод каскадной амплификации. Для обогащения конъюгатов ферментом можно использовать для конъюгации предварительно полимеризованный фермент , Ii, , оригинальный способ увеличения количества фермента состоит во включении его в липосомы , . Метод каскадной амплификации, предложенный сотрудниками фирм Ропт , v, , i , i, и другими авторами i, , , основан на использовании в качестве метки и субстрата пары профермент активатор профермента. Например, трипсиноген кишечная энтеропептидаза энтерокиназа. Другой путь комбинации ферментов, предлагаемый фирмой x, также связан с использованием субстрата, продукт расщепления которого первым ферментом служит субстратом для второго , i, i, , . Всякая процедура химической модификации фермента, даже такого, как пероксидаза, связана с потерей части активности, как при конъюгации, так и при хроматографической очистке конъюгата. Этого можно избежать, если в число реагентов ввести специфическое антитело к ферменту i, ii, , i, . Введение небольшого количества конкурентного лиганда в антитело, как правило, существенно не влияет на его иммунологические свойства , i, , а комплекс модифицированного антиферментного антитела с ферментом уже является готовым меченым реагентом.