Разработка метода культивирования патогенных микобактерий на перевиваемой культуре клеток

• Автор: Алексеев, Александр Юрьевич
• Шифр специальности: 16.00.03, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 158 с. : ил.

1. ОЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Туберкулез

1.1.1. Туберкулез в сельском хозяйстве

1. 1.2. Исторические аспекты

1.1.3. Таксономия микобактерий туберкулезного комплекса

1.1.4. Туберкулез лабораторных животных

1.2. Методы культивирования микобактерий туберкулезного

комплекса

1.2.1. Исторические аспекты

1.2.2 Морфологические, тинкториальные и культуральные

характеристики микобактерий туберкулезного комплекса

1.2.3. Ультраструктурная организация микобактерий туберкулезного комплекса
1.2.4. Культивирование микобактерий туберкулезного комплекса на твердых питательных средах
1.2.5. Культивирование микобактерий туберкулезного комплекса на
жидких питательных средах
1.2.6. Проблемы сохранения свойств музейных и коллекционных штаммов микобактерий туберкулезного комплекса неизмененными
при длительном культивировании
1.3. Заключение
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы
2.1.1. Бактериальные штаммы.
2.1.2. Перевиваемые культуры клеток.
2.1.3. Питательные среды.
2.1.4. Лекарственные препараты.
2.1.5. Животные.
2.1.6. Культивирование микобактерий туберкулезного комплекса на
плотных и жидких питательных средах. щ
2.1 П. Подготовка линий перевиваемых культур клеток к
совместному культивированию.
2.1.8. Техника заражения лабораторных животных.
2.1.9. Техника приготовления и окраски мазков.
2.1 Методика оценки патологических изменений внутренних
органов морских свинок.
2.1 Методика определения КОЕ колония образующих единиц.
2.1 Методика определения высеваемости микобактерий туберкулеза из внутренних органов морских свино.
2.1 Электронная микроскопия образцов микобактерий.
2.2. Результаты исследований.
2.2.1. Изучение сохранения морфологических и культуральных свойств i i при длительном
ф культивировании на перевиваемой культуре клеток.
2.2.1.1. Культивирование i i штамм В1с использованием ростовой среды II и культуры клеток V в течение 5 пассажей.
2.2.1.2. Культивирование i i штамм В2 с использованием ростовой среды II и культуры клеток V в течецие 5 пассажей.
2.2.2 Изучение морфологических и кулыуральныхсвойств
микобактерий туберкулезного комплекса при культивировании на перевиваемой культуре клеток.
2.2.2.1. Культивирование i i штамм В1 с использованием ростовых сред Игла МЕМ в модификации
Дульбеко с 0,2 V фракция и Игла МЕММД, II и культур клеток V и ПК.
2.2.2.2. Культивирование микобактерий туберкулезного комплекса с использованием ростовой среды Игла МЕМ в модификации Дульбеко с 0,2 V фракция и Игла МЕММД
и культуры клеток V.
2.2.3 Изучение сохранения вирулентности и лекарственной
устойчивости микобактерий туберкулеза при длительном культивировании на перевиваемой культуре клеток.
2.2.3.1. Патологические изменения внутренних органов морских свинок, зараженных i i штамм В1, выращенными на выбранных питательных средах.
2.2.3.2. Высеваемость микобактерий из органов морских свинок, зараженных i i штамм В1, выращенным
на разных питательных средах.
2.2.3. Изучение изменения лекарственной устойчивости
i i штамм В1 при длительном культивировании его на среде Игла МЕМ в модификации Дульбеко с 0,2 V фракция и с монослоем перевиваемой культуры клеток V Игла МЕММД V.
2.2.4. Изучение характеристик роста микобактерий туберкулеза на
различных питательных средах.

2.2.4Л. Динамика роста i i штамм В1 на
различных питательных средах.
2.2.4.2. Определение количества колониеобразующих единиц
КОЕ i i штамм В1 при . культивировании его на различных питательных средах.
2.2.6. Изучение локализации i i штамм В
1 во время роста на культуре клеток V.
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
6. ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Игла МЕМ Игла МЕММД
Игла МЕММД
ПК
II
единицы
питательная среда для культур клеток
питательная среда Игла МЕМ в модификации Дульбеко с 0,2 V фракция и шМ
питательная среда Игла МЕМ в модификации Дульбеко с 0,2 V фракция и с монослоем перевиваемой культуры клеток V
колония образующие единицы
почка кошки перевиваемая линия культуры клеток почки кошки
vi i бычий сывороточный альбумин
питательная среда для культур клеток
почка зеленой мартышки перевиваемая линия культуры клеток почки зеленой мартышки.
ВВЕДЕНИЕ


В связи с вышеизложенным, разработка метода, позволяющего
сохранять биологические свойства i i x неизмененными в процессе длительного культивирования, является актуальной проблемой биологической науки. Целью настоящей работы является разработка метода длительного культивирования патогенных микобактерий на основе перевиваемой культуры клеток и изучение сохранения биологических свойств
микобактерий при его применении. Для достижения этой цели решались следующие задачи
1. Определение локализации i i во время роста на перевиваемой культуре клеток. Научная новизна работы. Впервые для приближения условий культивирования i i x к естественным условиям в качестве компонента в среде использована перевиваемая культура клеток. Впервые достигнуто сохранение биологических свойств морфологических, культуральных, вирулентных i i x в процессе длительного культивирования при совместном культивировании микобактерий и перевиваемых культур клеток. Впервые показано, что микобактерии туберкулеза не проникают в клетку во время роста на перевиваемой культуре клеток V. Теоретическая и практическая значимости работы. Результаты проведенных исследований являются экспериментальнотеоретической базой для решения проблемы сохранения биологических свойств выделяемых и хранящихся штаммов патогенных микобактерий в изменяющихся условиях существования. Разработан метод длительного культивирования микобактерий туберкулеза на перевиваемой культуре клеток, позволяющий сохранять биологические свойства микобактерий неизмененными в процессе культивирования. На метод культивирования получен патент РФ Метод культивирования микроорганизмов i i 9, от г. Проведенные исследования позволяют использовать разработанный метод для сохранения биологических свойств патогенных микобактерий разных видов i i, i vi, i vi неизмененными в процессе длительного культивирования. Рекомендации утверждены Ученым советом ПТУ ИЭВСиДВ протокол 7 от сентября г. Инфекционная патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока ветеринарной медицины Россельхозакадемии протокол от сентября г
Апробация работы. Международном семинарепрезентации инновационных научнотехнических проектов в области биотехнологии Биотехнология , Россия, Пущино, сентября, г. Н.К. Военномедицинской академии, Россия, СанктПетербург, октября, г. Сибири, . Крайнего Севера, Новосибирск, Россия, мая г. II Международной научнопрактической конференции Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья животных, Россия, Ставрополь, остября, г. Конференции молодых ученых СО РАМН по проблемам фундаментальной и прикладной медицины, Россия, Новосибирск, июня, г. VIII Съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов ипаразитологов, Москва, марта г. Межрегиональной научной конференции, посвященной 0летию со дня рождения академика АМН СССР С. Разработаны методические рекомендации Метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток. Рекомендации утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ протокол 7 от сентября . Инфекционная патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока ветеринарной медицины Россельхозакадемии протокол от сентября гг. Разработан новый метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток, позволяющий сохранять морфологические, культуральные, вирулентные характеристики и лекарственную устойчивость микобактерий неизмененными в процессе длительного культивирования. Метод культивирования на перевиваемой культуре клеток чувствительнее культивирования на жидких питательных средах в 0 раз. Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано научных работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 3 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов,, выводов, практических предложений, списка используемой литературы и приложения. Работа иллюстрирована таблицами и рисунком. Списокиспользуемой литературы включает 3 источника, в том числе иностранных авторов.