Разработка иммуноферментного метода диагностики стрептококковой инфекции

• Автор: Ашурова, Зебуниссо Джамаловна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика стрептококков

1.1.2. Этиологическая роль стрептококкозов в патогенезе различных заболеваний

1.1.3.Антигенная структура стрептококков

1.1.4.Классификация стрептококков 1.2.0сновные методы диагностики

1.2.1. Иммуноферментный анализ в диагностике инфекционных заболеваний

1.2.2.Ферменты и субстраты, используемые в иммуноферментном анализе.

1.2.3. Применение иммуноферментного анализа для диагностики стрептококковых инфекций

2. Собственные исследования

2.1.Материалы и методы

2.1.1.Материалы
2.1.2.Методы исследований
2.2. Статистические методы
3.Результаты исследований
3.1.Культивирование Б. ецш виЬзр. оереппси
3.2.Получение специфических антистрептококковых сывороток
3.2.1.Совершенствование метода получения стрептококковых антигенов для гипериммунизации.
3.2.2.Изыскание оптимальных вариантов схем для иммунизации
3.3.Результаты испытания антистрептококко вых сывороток на активность и специфичность
3.4. Получение реагентов набора ИФА.
3.4.1. Получение иммунопероксидазных конъюгатов и отработка постановки иммуноферментного анализа.
3.4.2. Выделение и сравнительный химический состав антигенных препаратов 8. i БиЬэр. гооер1с1егтси8 полученных разными методами
3.4.3. Иммуноферментный анализ с антигенами, полученными различными методами.
3.4.4. Определение оптимальных условий проведения ИФА
3.4.5. Определение оптимального разведения конъюгата
3.4.6. Подбор индикаторной смеси
3.5. Экспериментальные испытания
твердофазного иммуноферментного
анализа
4. Обсуждение результатов исследо
ВЫВОДЫ
Практическое использование полу
ченых научных результатов
Рекомендации по использованию по
лученных научных результатов
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Результат реакции оценивают по интенсивности окрашивания визуально или используют автоматизированные методы учета. В ветеринарии иммунофсрментный анализ используют для обнаружения возбудителей инфекционных болезней животных и птиц. Ньюкасла, к возбудителю чумы свиней и др. При разработке препарата для диагностики стрептококковой инфекции необходимо определить, какие из бактериальных антигенов играют ведущую роль в ходе патологического процесса. В многочисленных исследованиях, посвященных этому вопросу ранее, было показано, что полисахариды клеточной стенки стрептококков играют основную роль в стимуляции иммунного ответа и создании иммунитета к стрептококку гомологичного серотипа ,, 7, 0,0. Это послужило основанием для использования Сполисахарида в качестве специфического реагента антигена в иммуноферментном анализе. Классические иммунологические тесты, такие как РА, РДП, РП по выявлению специфических антител к стрептококкозам животных требуют титрования. При этом невысокая чувствительность и значительная доля субъективизма в учете этих реакций, связанного с тем, что, как правило, нелегко отличить слабую положительную реакцию от отрицательной с достаточной надежностью . Альтернативным является иммуноферментный анализ, позволяющий непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с антителом, а не анализировать вторичные их проявления агглютинацию, преципитацию или гемолиз. Результативность метода иммуноферментного анализа зависит от активности, специфичности и стабильности всех компонентов реакции. В связи с этим, целью настоящего исследования явилась разработка ИФА теста для диагностики стрептококковой инфекции. Отработка режимов выделения и очистки антигена штамма 8. БиЬБр. Разработка схемы гипериммунизации и получение специфической сыворотки и иммуноглобулина к стрептококковым антигенам. Отработка параметров коньюгирования иммуноглобулинов гаммаглобулина пероксидазой хрена и получение специфического конъюгата. Составление набора ИФА для выявления противострептококковых антител в биологических жидкостях, подбор оптимальных параметров постановки ИФА. Экспериментальные испытания ИФА выявления антител к 8. БиЬэр. ЗегтсиБ. Научная новизна результатов исследования. Впервые для серологической диагностики инфекционных болезней животных, вызываемых Б. Бэр. ИФА. Метод показал высокую чувствительность и специфичность и позволял выявлять поствакцинальные и постинфекцинные специфические антитела. Разработаны биотехнологические параметры получения кроличьих гипериммунных референссывороток и иммуноглобулинов к растворимым антигенам 8. БиЬБр. Изучены условия адсорбции антигенов стрептококка на полистироловых планшетах. Практическая значимость результатов исследования. Разработана тестсистема для диагностики стрептококкозов животных, вызываемых 8. Ьвр. ИФА и нормативная документация на опытнопромышленное производство антигенного иммуноферментного стрептококкового диагностикума СТО Технические условия, инструкция по применению. Практическое применение антигенного иммуноферментного стрептококкового диагностикума позволит повысить диагностическую значимость лабораторных исследований, проводить серологический мониторинг и прогнозировать стрептококкозы у животных. Материалы исследований включены в учебные программы кафедр иммунология и биотехнология ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина. Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на научнопрактической конференции г. По теме диссертации опубликовано 4 научных работ. Результаты исследований по обоснованию и разработке ИФА теста для серологической диагностики стрептококковой инфекции, вызываемой Б. Бибэр. Результаты экспериментальных испытаний разработанного ИФА теста для серологической диагностики и мониторинга стрептококковой инфекции у животных. Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 4 источника, из которых 0 иностранных и приложение.