Разработка биолюминесцентного метода определения количества живых бактерий в лиофилизированных вакцинах

• Автор: Балинер, Лев Михайлович
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 96 с. : ил

1.1. Специфическая профилактика сальмонеллезов сельскохозяйственных животных

1. 2. Производство лиофилизированных бактериальных вакцин

1.2. 1. Факторы, влияющие на выживаемость бактерий при изготовлении лиофилизированных вакцин

1.2. 1. 1. Условия культивирования микроорганизмов

1.2. 1.2. Концентрация бактерии в суспензии

1.2. 1.3. Устойчивость разных видов микроорганизмов к замораживаниювысушиванию

1.2. 1.4. Защитные среды и криопротекторы

1.2. 1.5. Сублимационное высушивание биопрепаратов

2. 1.6. Остаточная влажность препарата

1.2. 1.7. Газовая фаза гфи хранении сухих биопрепаратов и повреждающее действие кислорода

1.2. 1.8. Условия хранения высушенных вакцин

1. 2. 2. Контроль лиофилизированных вакцин
1. 3. Косвенные методы определение количества жизнеспособных микробных клеток
стр
1. 4. Определение количества жизнеспособных микробных клеток
биолюминесцентным методом при помощи люциферинлюциферазной системы светляков
1.4. 1. Применение люциферазы светляков для решения биоаналитических задач
1. 4. 2. Методология биолюминесцентного определения количества микробной биомассы
1. 4. 2. 1. Подготовка образцов для определения АТФ
1.4.2. 2 Методы экстракции внутриклеточного АТФ
1. 4. 2. 3. Применение АТФметрии для контроля качества
защитных сред при изготовлении лиофилизированных вакцин
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. 1. Вещества, реагенты и материалы
2. 2. Объекты исследования
2. 3. Использованная аппаратура
2. 4. Методики проведения экспериментов
2. 4. 1 Получение лиофилизированной вакцины урМтипит
2. 4. 1. 1. Приготовление культуры 5. фрЫтипит
2. 4. 1. 2. Приготовление защитной среды
2. 4. 1.3. Приготовление суспензии бактерий с определенной
концентрацией
2.4. 1.4. Лиофилизация
2. 4. 1. 5. Контроль остаточной влажности
2. 4. 2. Определение количества живых бактерий методом посева предельных разведений
2. 4. 3. Измерение концентрации АТФ в бактериальных суспензиях биолюминесцентным методом 2. 4. 3. 1. Приготовление растворов и экстрактов АТФ 2. 4. 3. 2. Измерение биолюминесцентного сигнала 2. 4. 3. 3. Расчет концентрации АТФ
2. 4. 4. Расчет титра клеток по результатам биолюминесцентных измерений
2. 5. Статистическая обработка результатов 2. 6. Результаты и обсуждения
2. 6. 1. Изготовление опытных серий живой вакцины на основе
производственного штамма .ii 3 и изучение влияния
защитной среды и разных режимов лиофилизации на выживаемость бактерий
2.6. 1. 1. Изучение влияния защитной среды на выживаемость бактерий .ii
2. 6. 1. 2. Разработка оптимального режима сублимационной сушки . ii
2. 6. 2. Биолюминесцентное определение количества живых бактерий в лиофилизированных вакцинах .ii
2. 6. 2. 1. Оптимизация измерения концентрации внутриклеточного АТФ в бактериальных суспензиях
2. 6. 2. 2. Определение титра клеток в лиофилизированных вакцинах .ii с использованием стандартных АТФрастворов первый способ
2. 6. 2. 3. Определение титра клеток в лиофилизированных вакцинах .ii с использованием стандартных АТФэкстрактов второй способ
2. 6. 3. Определение титра клеток в лиофилизированных бактериях . i штамм 5 и в промышленных образцах вакцин биолюминесцентным методом ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ источников
ПРИЛОЖЕНИЯ.
ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
АТФ аденозинтрифосфат
АМФ аденозинмонофосфат
ДМСО диметилсульфоксид
КОЕ колониеобразующая единица
ИФА имуноферментный анализ
ТХУ трихлоруксусная кислота
СУ коэффициент вариации
МПБ мясопептонный бульон
МПА мясопептонный агар
коэффициент корреляции
КЖ культуральная жидкость

ВВЕДЕНИЕ


СОДЕРЖАНИЕ. ГЛАВА 1. ГЛАВА 2. Приготовление культуры 5. Измерение концентрации АТФ в бактериальных суспензиях биолюминесцентным методом 2. Приготовление растворов и экстрактов АТФ 2. Измерение биолюминесцентного сигнала 2. Статистическая обработка результатов 2. Изготовление опытных серий живой вакцины на основе
производственного штамма . Изучение влияния защитной среды на выживаемость бактерий . Разработка оптимального режима сублимационной сушки . Биолюминесцентное определение количества живых бактерий в лиофилизированных вакцинах . Определение титра клеток в лиофилизированных вакцинах . Определение титра клеток в лиофилизированных вакцинах . Определение титра клеток в лиофилизированных бактериях . ПРИЛОЖЕНИЯ. Производство ветеринарных бактериальных вакцин основано на использовании культур микроорганизмов. Длительное сохранение жизнеспособности вакцинного штамма требует определенных условий и достигается в настоящее время несколькими способами периодическим рекультивированием в случае стабильных штаммов, хранением в глубоко замороженном или в лиофилизированном состоянии. Последний метод позволяет продолжительное время сохранять почти без изменений все свойства биопрепарата или продуцента, не требует больших экономических затрат при изготовлении и хранении . Однако лиофилизация бактериальных культур сложный технологический процесс, в результате которого некоторая часть микроорганизмов отмирает . Поэтому необходимо разработать такие условия лиофилизации, которые позволяют сохранять наибольший процент жизнеспособных клеток после высушивания. Анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что большинство физических, химических и биологических процессов при производстве сухих биопрепаратов влияют на количество живых микробных клеток в конечном продукте 1, , , , . Для производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза водоплавающих птиц в лабораторных условиях был определен оптимальный состав защитной среды и концентрация микробных клеток в 1 мл исходной суспензии, что позволило получить жизнеспособных клеток после лиофилизации . Однако остается значительное количество малоизученных факторов, влияющих на выживаемость бактерий в процессе лиофилизации. До сих пор условия лиофилизации бактерий подбираются эмпирическим путем изменяют какойлибо технологический параметр и определяют выживаемость бактерий.