Полиморфизм ДНК микобактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые реакции у сельскохозяйственных животных

• Автор: Першикова, Наталья Леонидовна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 112 с. : ил.

1. Обзор литературы.

1.1. Общие сведения о туберкулзе.

1.1.1. Источники и пути передачи микобактерий.

1.2. Диагностика туберкулза сельскохозяйственных животных

1.2.1. Аллергический метод

1.2.2. Патологоанатомичсский метод.

1.2.3. Бактериологическое исследование

1.2.4. Биологический метод биопроба.

1.3. Методы молекулярной биологии и их использование в диагностике туберкулза.

1.3.1. Полимеразная цепная реакция. Подбор праймеров

1.3.2. Штаммовое типирование микобактерий.

1.3.3. Секвенирование.
1.3.4. Филогенетический анализ
1.4. Особенности молекулярного строения и функционирования микобактерий
1.4.1. Генетический полиморфизм.
1.4.2. Мобильные элементы генома микобактерий.
1.4.2.1. Инсерции М. i, М. vi и М. i I0, I1, I.
1.4.2.2. Инсерции М. i x I, I и новая Iподобная последовательность.
1.4.2.3. Инсерции М. i I, I и I
1.5. Заключение по обзору литературы
2. Собственные исследования.
2.1. Материалы и методы.
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Анализ эпизоотической ситуации по туберкулзу в хозяйствах
Новосибирской области гг.
2.2.2. Микробиологическая характеристика исследуемой выборки изолятов микобактерий
2.2.3. Подбор и тестирование праймеров для постановки ПЦР.
Параметры ПЦР
2.2.3.1. Специфичность и чувствительность ПЦР для выявления ДНК микобактерий.
2.2.3.2. Тестирование при помощи ПЦР референтных штаммов микобактерий.
2.2.3.3. Тестирование при помощи ПЦР изолятов микобактерий.
2.2.4. Генотипирование обнаруженных микобактерий.
2.3. Определение нуклеотидной последовательности.
2.3.1. Генотипирование изолятов М. и М.
2.3.2. Генотипичекое разнообразие М. vi.
2.3.3. Полиморфизм iгена М. vi.
2.3.4. Генотипирование М. i
2.3.5. Генетическая характеристика изолята М. i.
2.3.6. Индикация и идентификация атипичных микобактерий у грызунов
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Метод особенно актуален для диагностики туберкулза, поскольку эффективен в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью в том числе форм, определение которых требует длительного культивирования или сложных питательных сред, а также внутриклеточных паразитов и персистирующих микроорганизмов М. Ю. Акснов и др. М. Ю. Шестопалов и др. В.В. Макаров и др. М.М. Vi . Наряду с этим метод ПЦР перспективен при проведении межвидовой и штаммовой идентификации туберкулзных и нетуберкулзных микобактерий . I. Лазовская и др. Для выявления ДНК микобактерий туберкулза в пробах используют различные праймеры. Одни направлены на амплификацию фрагментов ДНК генов, кодирующих микобактериальные антигены другие на амплификацию повторяемых последовательностей у микобактерий туберкулзного комплекса третьи на амплификацию рибосомальной РНК Н. З Хазипов и др. Таким образом, достижения современной биотехнологии позволяют, используя молекулярногенетические подходы, разрабатывать сверхчувствительные способы диагностики инфекционных болезней человека и животных, в том числе туберкулза крупного рогатого скота. Цель исследования изучить генетический полиморфизм и особенности филогенетических и популяционных взаимоотношений популяции микобактерий, циркулирующих среди сельскохозяйственных животных на территории Новосибирской области при помощи молекулярногенетических методов исследования. Провести подбор праймеров и оптимальных параметров проведения. ГИДР, определить е чувствительность и специфичность. Тестировать референтные штаммы и изолягы микобактерий. Определить степень сходства изолированных культур микобактерий внутри изучаемой видовой выборки и в сравнении с прототипными штаммами. Научная новизна. Разработана диагностическая ПЦР, использующая в качестве мишени iген . X3X3 для дифференциации . М. vi. Получены данные по нуклеотидным последовательностям фрагмента iгена М. X3X3 М. Определена степень сходства микобактерий с использованием популяционного и филогенетического методов исследования. Впервые от свиней на территории России выделен потенциально новый вид микобактерий М. Теоретическая и практическая значимость работы. Проведены подбор и тестирование олигонуклеотидных праймеров для детекции и дифференциации М. М. vi, М. Доказана их эффективность для видоспецифичной экспрессдиагностики туберкулза и проверена на ДНК штаммов и изолятов различных видов микобактерий. Утв. Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол 4, и Применение ДНКмаркеров при генетическом картировании культур i, i и i vi Утв. Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол 1,
Апробация работы. Результаты работы доложены на заседаниях Учного совета ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии Новосибирск, гг. Информационные технологии, информационные измерительные системы и приборы в исследовании сельскохозяйственных процессов, Новосибирск, , Iй международ. Новосибирск, г. Российской науч. Болезней Военномедицинской академии им. С.М. Кирова СанктПетербург, , междунар. Омск, г, III Российской науч. Новосибирск, , на междунар. Молекулярная биология Москва, . По материалам диссертационной работы опубликованы 6 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ. Объм и структура диссертации. Работа изложена на 0 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, выводов и списка литературы, включающего 0 источников, из них 8 на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами, рисунками. Результаты подбора и тестирования олигонуклеотидных праймеров, используемых в ПЦР для выявления ДНК микобактерий. Результаты изучения фрагмента гена рРНК потенциально нового вида микобактерий М. Результаты изучения генетического полиморфизма, филогенетических и популяционных характеристик выделенных изолятов как внутри группы, так и в сравнении с прототипными штаммами.