Определение количества живых микробных клеток в противобруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом

• Автор: Зверев, Дмитрий Сергеевич
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 92 с. : ил.

1.1. Специфическая профилактика бруцеллеза сельскохозяйственных животных

1.2. Методы определения количества жизнеспособных бактерий

1.2.1. Прямые методы анализа жизнеспособности микробной культуры

1.2.2. Косвенные методы определения количества жизнеспособных микробных клеток

1.2.2.1. Определение количества жизнеспособных микробных клеток биолюминесцентным методом при помощи люциферинлюциферазной системы светляков

1.2.2.2. Применение люциферазы светляков для решения биоаналитических задач

1.2.2.3. Методология биолюминесцснтного определения количества микробных клеток

1.2.2.4. Подготовка образцов для определения АТФ

1.2.2.5. Методы экстракции внутриклеточного АТФ

1.2.2.6. Применение АТФметрии для контроля качества лиофилизированных вакцин

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы
2.2. Методики проведения экспериментов
2.2.1. Определение оптической концентрации бактерий
2.2.2. Определение количества живых бактерий чашечным методом
2.2.3 Измерение концентрации АТФ в бактериальных суспензиях биолюминесцентным методом
2.2.3.1. Приготовление растворов и экстрактов АТФ
2.2.3.2. Измерение биолюминесцентного сигнала
2.2.3.3. Расчет концентрации АТФ
2.2.3.4. Расчет количества жизнеспособных клеток по результатам биолюминесцентных измерений
2.2.3.5. Статистическая обработка результатов
2.3. Результаты собственных исследований
2.3.1. Влияние внеклеточного АТФ в образцах вакцины на интенсивность сигнала биолюминесценции
2.3.2 Калибровка АТФреагента при использовании стандартных АТФрасгворов
2.3.3. Определение оптимальных объемов реакционной смеси реагентиспытуемый образец
2.3.4. Изучение экстрагирующих свойств неонола и влияния продолжительности экспозиции образца в экстрагенте на интенсивность биолюминесцентного сигнала
2.3.5. Определение возможности получения экстрактов лиофилизированной культуры бруцелл в ДМСО
2.3.6. Влияние длительности инкубирования водной суспензии бруцелл после восстановления лиофилизированной куль
туры на концентрацию АТФ
2.3.7. Определение количества жизнеспособных клеток в лиофилизированных вакцинах
2.3.8. Биолюминесцентное определение количества жизнеспособных бруцелл в лиофилизированных бруцеллезных вакцинах на разных сроках хранения
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ГЛАВА 1. ГЛАВА 2. Материалы и методы
2. Бруцеллез сельскохозяйственных животных, являясь широко распространенной инфекцией, наносит существенный экономический ущерб животноводству, обусловленный массовыми абортами, бесплодием и яловостью маточного поголовья, снижением их продуктивности и жизнеспособности приплода, а также затратой значительных сил и средств на его ликвидацию , 0. Бруцеллез является зоонозом и относится к особо опасным инфекционным заболеваниям 1, 6. В России для борьбы с бруцеллезом животных проводится комплекс организационнохозяйственных и ветеринарносанитарных мероприятий, успех которых во многом определяется применением средств специфической профилактики, преимущественно живых сухих вакцин 6, 5. Продолжительность жизнеспособности бруцелл в составе вакцины требует соблюдения ряда условий , . В частности, на выживаемость бруцелл при производстве и в процессе храпения вакцин влияют физические, химические и биологические факторы 4, , , 1, 0. При этом количество жизнеспособных микробных клеток определяет количество иммунизирующих доз в конкретном объеме вакцины, а их количество в дозе, наряду со свойствами штаммов ее иммуногенность. В связи с этим, контроль выживаемости бруцелл в живых бруцеллезных вакцинах осуществляют на прсдприягиипроизводителе при их выпуске, а также в ФГУ ВГНКИ в порядке проведения контроля за сертифицированной продукцией в процессе хранения , ,, 1. В настоящее время для этой цели используют культуральный и биохимический методы. Культуральный метод определение количества живых бруцелл колониеобразующих единиц КОЕ по числу колоний бруцелл, выросших на плотной питательной среде является достаточно трудоемким и позволяет получить результат через 5 суток. Биохимический метод в част
ности, оценка дегидрогеназной активности бруцелл в отношении метиленового синего проще по воспроизведению и сокращает время анализа до часов. Однако результаты исследований, полученные с помощью этих методов, не всегда коррелируют , , 2. Анализ данных литературы, посвященной контролю выживаемости микроорганизмов в живых бактерийных вакцинах, показал, что с начала второй половины прошлого века были предложены и апробированы косвенные экспрессметоды, основанные на измерении какоголибо физикохимического параметра образца, абсолютная величина которого или е изменение пропорциональны количеству жизнеспособных клеток в образце. Среди достаточно большого разнообразия таких методов высокой точностью и воспроизводимостью отличались методы, основанные на определении содержания различных внутриклеточных или внеклеточных метаболитов, в первую очередь, внутриклеточного аденозинтрифосфата АТФ, содержащегося в относительно высоких концентрациях в клетках любых микро и макроорганизмов. Количество АТФ с большой точностью можно определить при помощи биолюминесцентного метода даже при ультрамалом содержании в образце до молькювета люминометра , 2. Причем, после гибели клетки содержание АТФ в них, в отличие от других внутриклеточных метаболитов, резко снижается в течение нескольких секунд 5. Таким образом, количество АТФ коррелирует с количеством живых микробных клеток, содержащихся в анализируемом образце. Процедура биолюминесцентного определения АТФ получила достаточное распространение в разных областях биометрии. Многие фирмы производят коммерчески доступные АТФреагепгы и приборы для детекции биолюминесценции люминометры, как портативные, так и стационарные. Их стоимость, по сравнению с большинством оптических приборов, невелика.