Моноклональные антитела к антигенам Bac. anthracis: получение и применение

• Автор: Романов, Михаил Геннадьевич
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Морфология i i

1.2 Секретируемые факторы вирулентности Вас.i

1.3 Сибирская язва и е диагностика

1.4. Иммунитет и иммунизация.

1.5. Производство моноклональных антител и их практическое применение.

1.5.1. Применение моноклональных антител

1.5.2. Диагностика бактериальных инфекций.

1.5.3. Перспективы терапевтического применения

1.5.4. Принципы получения моноклональных антител

1.6. Применение МкАт для изучения сибирской язвы и е обнаружение в объектах исследования.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Лабораторные животные.
2.2. Антигены
2.3. Штаммы
2.4. Сыворотки, антитела.
2.5. Антисыворотки.
2.6. Иммунизация.
2.7. Приготовление ультразвуковых дезинтегратов микробных клеток
2.8. Синтез конъюгатов антител с пероксидазой хрена
2.9. Миеломные клетки
2 Культуральные среды.
2 Посуда.
2 Подготовка миеломных клеток к слиянию
2 Приготовление слоя фидерных подкормочных клеток
2 Получение иммунных спленоцитов.
2 Раствор полиэтиленгликоля
2 Гибридизация клеток
2 Отбор гибридных культурпродуцентов специфических антител первичное тестирование
2 Клонирование гибридных клеток
2 Заморозка и разморозка гибридных и миеломных клеток
2Культивирование гибридных клеток i viv
2 Очистка моноклональных антител.
2 Использование штаммов гибридных культивируемых клеток для получения моноклональных антител
2 Исследование специфичности иммунохимических свойств МкЛт
21. Твердофазный иммуноферментный анализ
22. Иммуноблотгинг
23. Определение изотипа МкАт
2. . Определение концентрации белка.
2. . Статистическая обработка результатов.
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ Вас. i, ИХ ВЫДЕЛЕНИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
3.1. Иммунизация.
3.2. Подбор условий постановки твердофазного иммуноферментного анализа ИФА.
3.3. Гибридизация
3.3.1. Подготовка клеток к слиянию, гибридизация
3.3.2. Получение первичных культур гибридных клеток.
3.3.3. Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных дезинтегратом спор вакцинного сибиреязвенного штамма ВНИИВВиМ
3.3.4. Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных дезинтегратом вегетативных клеток суточной культурой вакцинного сибиреязвенного штамма ВНИИВВиМ
3.3.5. Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных очищенным протективным антигеном Вас. i

3.4. Изучение свойств моноклональных антител
3.4.1. Изучение видовой специфичности моноклональных антител
3.4.2. Культивирование гибридомпродуцентов, продуцирующих антитела i viv.
3.4.3. Определение изотипа моноклональных антител.
3.4.4. Иммунохимический анализ
ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ МКАТ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПА Вас. i
4.1. Приготовление конъюгатов на основе моноклональных антител
4.2. Подбор пары МкАт для сэндвичИФА.
4.3. Сравнение различных вариантов ИФА для количественного определения ПА с использованием полученных МкАт
ГЛАВА 5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МКАТ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ЛАБОРАТОРНОГО АНАЛИЗА
СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ.
5 .1. Использование МкАт для идентификации Вас. i.
5.2. Оценка возможной пригодности полученных МкАт для характеристики живых споровых вакцинных штаммов и для стандартизации бесклеточных вакцинных препаратов.
5.3. Перспективы использования МкАт для определения уровня защищенности животных от заражения сибирской язвой, привитых различными вакцинными штаммами.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных дезинтегратом вегетативных клеток суточной культурой вакцинного сибиреязвенного штамма ВНИИВВиМ
3. Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных очищенным протективным антигеном Вас. Культивирование гибридомпродуцентов, продуцирующих антитела i viv. Определение изотипа моноклональных антител. ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ МКАТ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПА Вас. Подбор пары МкАт для сэндвичИФА. ГЛАВА 5. СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ. Использование МкАт для идентификации Вас. Оценка возможной пригодности полученных МкАт для характеристики живых споровых вакцинных штаммов и для стандартизации бесклеточных вакцинных препаратов. Перспективы использования МкАт для определения уровня защищенности животных от заражения сибирской язвой, привитых различными вакцинными штаммами. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ВЫВОДЫ. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ. Сибирская язва, болезнь, которая относится к числу особо опасных зоонозных инфекций, поражающая сельскохозяйственных животных крупный и мелкий рогатый скот, лошадей, ослов, верблюдов, диких млекопитающих, а также человека, продолжает регистрироваться во многих странах и причиняет большой экономический ущерб 3, 7, 8. Высокая заболеваемость обусловлена тем, что возбудитель сибирской язвы способен неопределнно долго сохранять жизнеспособность в почве в виде спор и образовывать стойкие стационарные очаги инфекции. Существование таких очагов в разных регионах мира, в том числе и на территории России, создает постоянную угрозу возникновения эпизоотий и заражения людей, которые могут инфицироваться в процессе переработки и использовании животноводческой продукции, полученной от больных животных мясо, шкуры, шерсть и др По данным Всемирной организации здравоохранения в мире ежегодно заболевает около тыс. В России в настоящее время зарегистрировано около тыс. Однако, в силу исторических, социальных и экономических обстоятельств большое количество скотомогильников, одиночных мест гибели или захоронений остатся неучтнным, и по данным ряда исследователей именно они являются источником поступления возбудителя сибирской язвы в природную среду 7. В итоге, государственный комитет санитарноэпидемиологического надзора Госкомсанэпиднадзор Минздрава РФ оценивает эпидемическую обстановку в отдельных регионах страны как напряженную 3, 7. Перспективы совершенствования методов борьбы с сибирской язвы, как в медицинской, так и в ветеринарной практике напрямую связаны с созданием и применением в повседневной работе быстрых и достоверных методов обнаружения и идентификации возбудителя, а также с совершенствованием существующих средств профилактики. Иммунохимические методы, которые успешно применяются для индикации патогенных микроорганизмов и соответствующих антител уже более лет, позволят во многом решить эту проблему 8, . Примером могут служить созданные за последние годы лабораторные тестсистемы для диагностики таких болезней как бруцеллез, туберкулз, бешенство, иерсиниоз и др. В основу всех без исключения иммунохимических методов анализа положено образование высокоспецифического комплекса между антигеном и антителом, в котором в качестве антигена могут выступать низкомолекулярные химические соединения гаптены, белковые молекулы микробного или растительного происхождения, а также различные микробиологические объекты бактерии, риккетсии, вирусы и тд. Главная задача при разработке иммунодиагностической тестсистемы состоит в визуализации единичных взаимодействий антигена с антителом путем регистрации макроскопического сигнала или по изменению физических свойств среды, а также увеличение чувствительности и специфичности иммуноанализа, достигаемое за счт получения антител с максимальным аффинитетом к искомому антигену и разработке молекулярных систем усиления результата специфического взаимодействия антигена с антителом. Наиболее яркими примерами в этой области являются создание гибридомной технологии для получения моноклокнальных антител МкАт с заданными свойствами.