Молекулярно-генетический анализ распространения токсигенной микрофлоры

• Автор: Плугина, Ирина Владимировна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: п.Родники, Московс.обл.
• Количество страниц: 143 с. : ил.

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Систематика семейства ЕгйегоЬааепассас

1.2. Факторы патогенности и генетический контроль синтеза энтеротоксинов.

1.3. Классификация и молекулярная организация энтеротоксинов.

1.4. Механизм действия энтеротоксинов .

1.5. Методы детекции токсигенной микрофлоры .

1.5.1. Методы биологического тестирования энтеротоксинов

1.5.2. Иммунологические методы детекции энтеротоксинов

1.5.3. ДНКДНК гибридизация .

1.5.3.1. Принцип метода гибридизации. Методы гибридизации .

1.5.3.2. Гибридизациопные ДНКзонды .
1.5.3.3. Введение метки в нуклеиновые кислоты .
1.5.3.4. Способы введения метки в ДНКзонды .
1.5.4. Полимеразная цепная реакция
1.5.4.1. Принцип метода ПЦР .
1.5.4.2. Этапы полимеразной цепной реакции
1.5.4.3. Компоненты реакционной смеси ПЦР .
1.5.4.4. Условия проведения ПЦР
1.5.4.5. Детекция результатов ПЦР
1.5.4.6. Интерпретация результатов ПЦР
1.5.4.7. Способы повышения чувствительности ПЦР .
1.5.4.8. Достоинства метода ПЦР .
1.5.4.9. Практическое применение ПЦР при диагностике токсикоинфекций Собственные исследовании
2. Материалы и методы .
2.1. Оборудование .
2.2. Использованные реактивы
2.3. Буферные растворы
2.4. Штаммы и плазмиды
2.5. Питательные среды
2.6. Определение биохимических свойств культур
2.7. Получение биомассы
2.8. Выделение плазмидной ДНК .
2.9. Очистка плазмидной ДНК .
2 Электрофорез ДНК
2 Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции
2 Извлечение ДНК из легкоплавкой агарозы
3
7

























2
7

2 Выделение ДНК из агарозных гелей с использованием сорбента ЗДаБзМШс .
2 Генетическая трансформация Е.соН .
2 Введение биотиновой метки в препараты ДНК
2 ДНКДНК гибридизация с биотинилированными зондами
2 Детекция результатов гибридизации
2 Полимеразная цепная реакция
2 Подбор оптимальных условий проведения ПЦР
3. Результаты исследовании
3.1. Выделение штаммов энтеробактерий, контаминирующих кормосмеси для норок
3.2. Изучение биохимических свойств штаммов и их идентификация .
3.3. Определение патогенности изолированных штаммов
3.3.1. Биологические методы тестирования .
3.3.1.1. Изучение патогенных свойств подкожным введением .
3.3.1.2. Определение наличия токсинообразования
3.3.1.2.1. Определение наличия термостабилыюго токсина БТ .
3.3.1.2.2. Определение наличия термолабильного энтеротоксина ЬТ .
3.3.2. Молекулярногенетические методы тестирования
3.3.2.1. Конструирование диагностических ДНКзоидов
3.3.2.1.1. Получение зондов на гены отдельных субъединиц термолабильного токсина
3.3.2.1.2. Биотиннлированне зондов и определение включения метки
3.3.2.1.3. Получение зонда на полноразмерный ЬТоперон
3.3.2.2. Анализ штаммов на наличие генов токсинообразования
3.3.2.2.1. Оптимизация условий гибридизации .
3.3.2.2.2. Изучение распространения генов токсинообразования методом ДНКДНК гибридизации .
3.3.2.2.3. Определение генов шигаподобных токсинов БЬИ и бЬТП методом гибридизации с радиоактивным зондом
3.3.2.3. Разработка метода полимеразной цепной реакции для детекции генов токсинообразования у энтеробактерий .
3.3.2.3.1. Анализ первичных последовательностей и подбор праймеров
3.3.2.3.2. Оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции
3.3.2.3.3. Изучение распространения генов токсинообразования методом ПЦР
4. Обсуждение результатов
5. Выводы
6. Сведении о практическом использовании результатов .
7. Список литературы .
8. Приложении
ВВЕДЕНИЕ


Они остаются нерешнной проблемой
здравоохранения и являются причиной высокой смертности , . Факторами передачи бактерий являются инфицированные продукты и вода , i, . Заражение происходит перорально. Ранней неспецифической фазой инфекционного процесса является размножение бактерий в просвете пищеварительного тракта и достижения специфических рецепторов на мембранах слизистой тонкой кишки. Последние годы отличаются бурным прогрессом в области изучения молекулярных механизмов действия энтеротоксинов н их генетического контроля. Опероны, кодирующие структуру ряда энтеротоксинов клонированы в составе векторных плазмид и определена их нуклеотидная последовательность , , , , , i, , . Молекулярнобиологическое исследование направлено не только на решение фундаментальных задач, но и на создание лечебнопрофилактических препаратов вакцинных штаммов, пробиотиков и диагностических методов определения энтеротоксигенных штаммов. Используя технологии клонирования определнных фрагментов ДНК стала возможной идентификация реальных и потенциальных токсинпродуцирующих штаммов с помощью ДНКгибридизации i . Руководствуясь распространнной классификацией, энтеротоксины принято подразделять на цитотон и ческие и цитотокснческие , , . Принципиальным отличием между ними является характер их специфического действия на клеточные структуры кишечника макроорганизма. Бактерии, продуцирующие цитотонические токсины, не способны проникать в клетки эпителия слизистой кишечника и вызывать гистологические изменения. Колонизируя тонкий кишечник без повреждения эпителия, они вызывают патологический процесс за счт продукции токсинов, ведущий к гиперсекреции эпителия и энтеросорбции жидкости. Затем следует самоочищение поверхности эпителия от бактерий без развития воспаления. Л бактерии, продуцирующие цитотоксическис токсины, способны проникать внутрь и разрушать слизистую как тонкого, так и толстого кишечника, размножаясь в эпителиальных клетках V, , . К цитотоническим относят холерный СТ, термолабильный и термостабильный токсины, продуцируемые Vii , энтеротоксигенными кишечными палочками и некоторыми видами патогенных и условнопатогенными энтеробактерий. Vтоксинами эшерихий тоже шигаподобными. Таким образом, основными типами токсинов, продуцируемыми . Наиболее часто ЭТКП, возбудители диарей у животных и человека, образуют только термостабильные энтсротоксины или комбинации , реже . Указанные токсины имеют разновидности, различающиеся по биохимическим и иммунологическим характеристикам. Термолабильпые эшперотоксины высокомолекулярные белки, которые инактивируются при нагревании выше С в течение мин, при 4,,0 и под действием проназы. Интенсивное продуцирование энтеротоксигенными ii i наблюдается в течение логарифмической стадии роста и уменьшается в течение стационарной стадии роста ii . Увеличить продукцию возможно подщелачнванием среды, добавлением линкомицина 0 мкгмл . По структуре и функции очень близок к холерному токсину , vv, i . Оба токсина состоят из 2 субъединиц Л и В , ii, , , . Молекула токсина включает в себя I субъединицу А и 5 субъединиц В. Субъединица А, состоящая из 2 пептидов i и Аг . В не токсична и обеспечивает прикрепление молекулы токсина к специфическим клеточным рецепторам. Асубъединица мол. Д представляет собой полипептид, состоящий из 4 аминокислот из них являются сигнальной последовательностью, а субъединица В м. Д пептид, состоящий из 4 аминокислот из них входит в состав сигнальной последовательности . Прикрепление молекулы голотоксина к клеткам эпителия, осуществляется за счт связывания субъединицы В , . А проникает в клетку сквозь мембрану i . Под действием последней увеличивается внутриклеточный уровень адспилатциклазы, снижается концентрация калия и происходит выделение хлористого натрия, что ведт к потере клетками жидкости, развивается диарея , . Замена одной аминокислоты в Всубъсдинице приводит к тому, что она не может формировать голотоксин с родной Асубъсдиницей Ii . Асубъсдиницсй приводят к потере токсической активности Асубъединицы термолабильного энтеротоксина .