Генетические детерминанты токсинообразования в семействе Enterobacteriaceae

• Автор: Барановская, Оксана Петровна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с.

1. Введение

2. Обзор литературы.

2.1. Бактериальные токсины и их классификация

2.1.1. Энтеротоксины семейства Еп1егоЬас1епасеае в свете

современной классификации.

2.1.2 Распространение в природе.

2.1.3. ЬТэнтеротоксины

2.1.4. БТэнтеротоксины

2.1.5. Шигатоксины

2.2. Строение генов токсинообразования.

2.2.1. Строение генов ЬТ.

2.2.2. Строение генов БТ.
2.2.3. Регуляция синтеза токсинов на генном уровне
2.3. Факторы адгезии
2.4. Локализация генов токсинообразования в геноме бактерий.
2.4.1. Хромосомная локализация генов токсинообразования.
2.4.2. Внехромосомная локализация генов токсинообразования.
2.4.2.1. Плазмиды.
2.4.2.2. Транспозоны
2.4.2.3. Бактериофаги.
2.5. Генетический обмен
2.5.1. Роль внехромосомных элементов в формировании токсического фенотипа и распространении токсикоинфекций
2.5.2. Трансформация.
2.5.3 Конъюгация
2.5.4. Трансдукция.
3. Материалы и методы
3.1. Штаммы бактерий и бактериофагов











4
6
Используемые реактивы и среды.
Буферные растворы и среды.
Выделение плазмид с помощью щелочного лизиса
Выделение высокомолекулярной плазмидной ДНК.
Выделение ДНК модифицированным методом Экхарда
Проведение расщепления ДНК рестршсгазами
Электрофорез ДНК
Трансфекция
Транспозиция.
Получение препаратов фагаМ .
Определение титра бактериофагов.
Конъюгация.
Споттест
Экспериментальная часть.
Определение оптимальных условий выделения плазмидной
ДНК
Анализ плазмидных профилей изучаемых штаммов Анализ обнаруженных плазмид на наличие генов
токсинообразования.
Рестрикционный анализ плазмид, кодирующих
токсинообразование.
Определение молекулярной массы плазмид
Определение копийности изучаемых плазмид
Изучение влияния дозы гена на уровень продукции токсинов Изучение возможности переноса генов токсинообразования
между различными штаммами . i.
Обсуждение результатов
Выводы.
Практические предложения
Список использованной литературы


Значительно меньше изучены плазмиды, кодирующие токсинообразование в штаммах, ведущих происхождение от сельскохозяйственных животных, и полностью отсутствуют данные о генетических детерминантах токсигенности штаммов, поражающих пушных зверей. Наблюдаемое в последние лет бурное развитие биотехнологии и генной инженерии дает возможность не только изучения, но и использования генетических детерминант токсигенности при создании диагностических и лечебнопрофилактических препаратов. Исходя из вышесказанного, изучение генетических детерминант токсинообразования в штаммах, изолированных из патологического материала, полученного от пушных зверей, представляется весьма актуальными своевременным. Целью нашей работы стало изучение генетических детерминант токсинообразования, их физикохимических и молекулярногенетических свойств у штаммов эшерихий, изолированных от пушных зверей. Определить наличие внехромосомных элементов в клетках токсигенных штаммов, изолированных от пушных зверей. Изучить плазмидные профили токсигенных штаммов и локализовать гены, кодирующие токсинообразование. Установить наличие корреляции между копийностью плазмид и уровнем токсинообразования. Изучить возможность горизонтального переноса генов токсинообразования в популяции энтеробактерий посредством конъюгации. Объектом исследования являлась коллекция штаммов энгеробактерий, выделенная из патологического материала, полученного от пушных зверей. Была выделена плазмидная ДНК, проведен анализ плазмидных профилей, установлены штаммы, содержащие xплазмиды, получены рестрикционные карты, определена устойчивость к антибиотикам, определена молекулярная масса и копийность, определено наличие в геноме фактора. В представленной работе впервые изучены молекулярногенетические особенности детерминант токсинообразования у энтеробактерий, изолированных от пушных зверей в зверохозяйствах РФ. Данная работа является одной из первых, посвященной изучению внехромосомных факторов инфекционной наследственности токсигенных штаммов . РФ. Также изучена возможность горизонтального переноса генов токсинообразования в популяции энтеробактерий посредством конъюгации. Результаты диссертационных исследований могут служить методологической основой для создания комплекса диагностических и лечебнопрофилактических средств для борьбы с токсикоинфекциями, обусловленными энтеротоксигенными эшсрихиями. Материалы настоящего исследования могут быть использованы при написании методических рекомендаций, а также в лекционном курсе по микробиологии. Изучение молекулярногенетических характеристик внехромосомных факторов наследственности, кодирующих токсинообразование у ЕТЕС. Определение корреляции между копийностью токсигениых плазмид и уровнем продукции энтеротоксинов. Под токсинами в настоящее время понимают любые регуляторные элементы, действующие в гетерологичных клеточных системах вне их контроля и сдвигающие равновесие протекающих в них физиологических процессов Вертиев, . Попадающие под это определение биомолекулы бактериального происхождения дифференцируют на четыре группы i . I Токсины, действующие на цитоплазматическую мембрану клеткимишени. Это гетерогенные бактериальные белки, связывающиеся с поверхностными молекулами клеткихозяина иили формирующие поры в ее цитоплазматической мембране. К ним относятся термостабильные энтеротоксины и транзиентные пороформирующие токсины X. Xтоксины представлены белками, имеющими повторы i xi. К ним относятся цитолизины, метаплопротеазы и липазы большинства грамотрицательных бактерий. В зависимости от клетокмишеней Xтоксины подразделяют на Xгемолизины, оказывающие токсическое действие как на эритроциты, так и на клетки других типов, и Xлейкоцитолизины, эффект которых видоспецифичен . Xтоксины обнаружены у ii, , . Их примером может служить гемолизин . Н1у, активация которого приводит к формированию нестабильных пор диаметром нм, через которые осуществляется катионспецифичный транспорт и осмотический лизис клетки ii . АВсубьединичные токсины. Это белки, состоящие из функциональных субъединиц А и В. Токсический эффект оказывает ферментативно активная субъединица А.