Биоразнообразие нитчатых сероокисляющих бактерий сульфидных экосистем Северного Кавказа : экологические и молекулярно-генетические аспекты

• Автор: Черноусова, Елена Юрьевна
• Шифр специальности: 03.02.08, 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 153 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. БЕСЦВЕТНЫЕ НИТЧАТЫЕ СЕРОБАКТЕРИИ

1.1. Экология бесцветных серобактерий

1.2. Таксономическое разнообразие бесцветных серобактерий

ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ТНЮТНШХ

2.1. Биологические особенности организмов рода ТЫоЬг1х

2.2. Таксономия

2.3. Экология

ГЛАВА 3. МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В

МИКРОБНОЙ ЭКОЛОГИИ

3.1. Принципы молекулярной экологии
3.2. Молекулярные маркеры, используемые в современной таксономии и филогении бактерий
3.2.1. Анализ генов Б рРНК
3.2.2. Анализ белоккодирующих генов вугВ и НярбО
3.3. Методы полимеразной ценной реакции Г1ЦР и клонирование основные инструменты молекулярноэкологических исследований
3.4. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК
3.5. Метод ТКИР
3.6. Методы ДНКтипирования
3.7. ДНКДНК гибридизация
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ
ЭКСПЕРИМЕ1ГГАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Методы, основанные на культивировании
4.1.1. Объекты исследования
4.1.2. Состав питательных сред
4.1.3. Методы изучения морфологии и внутриклеточных включений
4.1.4. Методы определения рас творенного кислорода
4.1.5. Анализ неорганических соединений серы
4.1.6. Анализ жирнокислотного состава на приборе Шерлок
4.1.7. Метод ацетиленредукции
4.2. Молекулярногенетические методы
4.2.1. Выделение и очистка хромосомной ДНК
4.2.2. Полимеразная цепная реакция ГЩР
4.2.3. Очистка ПЦРпродуктов
4.2.4. Клонирование генов Б рРНК
4.2.5. Определение нуклеотидной последовательности генов Б рРНК, ИзрбО и угВ
4.2.6. Филогенетический анализ
4.2.7. Полимеразная цепная реакция с праймерами к повторяющимся последовательностям КАРОПЦР
4.2.8. Определение ГЦ в ДНК и ДНКДНК гибридизация
4.2.9. ТКГЬРанализ
ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. i анализ микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий из сульфидных пресноводных систем Северного Кавказа
5.1.1. Получение суммарных препаратов ДНК и фракций генов рРНК из природных образцов микробных сообществ
5.1.2. Оценка разнообразия микробных сообществ сульфидных источников Краснодарского края методом клонирования генов рРНК
5.1.2.1. Разнообразие микробных сообществ, обнаруженных в г.
5.1.2.2. Разнообразие микробных сообществ, обнаруженных в г.
5.1.3. Определение видового состава микробных сообществ методом Г
5.1.3.1. анализ микробного сообщества из умеренно термального сульфидного источника Краснодарского края
5.1.3.2. анализ микробных сообществ сероводородных биотопов Ставропольского края и КабардиноБалкарии
5.1.4. Влияние экологических условий среды обитания на видовой состав микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий
5.1.4.1. Влияние концентрации сульфида на распределение доминирующих филотипов микроорганизмов в микробных сообществах из термальных сульфидных источников
5.1.4.2. Влияние температуры и уровня трофности водоемов на разнообразие микробных сообществ
5.2. x i анализ микробных сообществ нитчатых ссроокисляющих бактерий пресноводных сульфидных систем
Северного Кавказа
5.2.1. Анализ внутривидового генетического полиморфизма нитчатых сероокисляющих бактерий, выделенных их микробных сообществ сероводородных биотопов
5.2.2. Генетическая идентификация одноклеточных сероокисляющих
бактерий, выделенных из микробного сообщества умеренно термального источника Ставропольского края
5.3. Характеристика новых таксонов бесцветных нитчатых серобактерий
5.3.1. Морфологические и физиолого биохимические свойства
5.3.2. Филогенетический и генотипический анализ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


С помощью амплификации фрагментов генов Э рРНК из суммарной ДНК природного образца, их клонирования с последующим скринингом библиотеки клонов методами ПЦР, рестрикционного анализа ИРЬР и секвенирования проведен мониторинг биологического разнообразия микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий умеренно термальных сульфидных источников Краснодарского края и впервые выявлены структурные изменения микробного сообщества ТЫо1кг1хЗрИаегоШия в зависимости от концентрации сульфида в водах источников. С помощью метода ТИРЬР выявлена зависимость разнообразия видового состава микробных сообществ ТкюМгЬс умеренно термального источника Ставропольского края и низкотемпературного озера КабардиноБалкарии от экологических условий температуры и уровня трофиости водоемов. Сравнение двух методов молекулярной биологии и генетики для анализа бактериальных сообществ нитчатых серобактерий показало, что метод ТКБЬР позволяет выявлять только доминирующие компоненты, тогда как технология молекулярного клонирования обнаруживает и минорные компоненты микробных природных сообществ. Впервые показано участие представителей родов ЗркаегоШш и ЛгозртПит в качестве компонентов микробных сообществ в природных сульфидных экосистемах. Многочисленные изоляты рода 8рИаегоШш традиционно относили к группе органогетеротрофных железобактерий, а известные представители рода АгохрИИнт к ризобактериям, живущим на поверхности корневой системы растений и фиксирующим азот воздуха. В, результата анализа ДНКДНК гибридизации и сравнительного исследования фенотипических свойств описаны новые виды семейства ТЫоЫскасеае ТЫоИпх са1сИопИз Бр. ТЫоМпх аснягт эр. Исследования микробных сообществ в природных сульфидных экосистемах СевероКавказского региона позволили существенно расширить знания об экологии и биологии бесцветных нитчатых серобактерий, в частности, их филогенетическом и фенотипическом разнообразии, физиологии и генотипических характеристиках. Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы являются необходимой базой для дальнейших исследований филогенетического и фенотипического разнообразия бесцветных серобактерий, населяющих умеренно термальные и низкотемпературные сульфидные пресноводные системы. Апробированные подходы к анализу микробных сообществ могут быть использованы при микробиологическом мониторинге разнообразных водных экосистем природного и антропогенного происхождения. Полученная коллекция культур расширяет наши представления о микроорганизмах, задействованных в процессах окисления соединений серы, и может использоваться в биотехнологических исследованиях для очистки водных экосистем от токсичных серных соединений. Апробация работы. I. Международной молодежной школе конференции Акг,альные аспекты современной микробиологии Москва, . Международной молодежной школе конференции Биология наука XXI века Пущино, . Публикации. Материалы диссертации содержатся в печатных работах 6 экспериментальных статей и 5 тезисов. Статьи, опубликованные по теме диссертации, состоят в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 3 страницах, включает таблиц. Место проведения работы и благодарности. Работа была выполнена на кафедре биохимии и физиологии клетки Воронежского государственного университета под руководством д. Грабович М. Ю. Молекулярногенетические исследования проводились во время стажировок в рамках грантов РФФИ в лаборатории Всероссийской коллекции микроорганизмов института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Скрябина РАН Пущино под руководством к. Акимова В. Автор выражает глубокую признательность к. Лысенко А. М., д. Осипову Г. А., к. Кравченко И. К., д. Сорокину Д. Ю., д. Дубининой Г. А. и аспирантке Белоусовой Е. В. за помощь на отдельных этапах работы. Работа была выполнена при финансировании в рамках грантов РФФИ 2, 9, 1к и 5к. Автор выражает особую благодарность д. Грабович М. Ю. и к. Акимову В. Н. за помощь в формулировании положений диссертации, полезные советы и поддержку на всех этапах работы.