Характеристика примордиальных зародышевых клеток как векторов для генетической трансформации эмбрионов кур

• Автор: Томгорова, Евгения Константиновна
• Шифр специальности: 03.02.07, 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: п. Дубровицы Московской обл.
• Количество страниц: 103 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Особенности эмбриогенеза кур.

Генетическая трансформация эмбрионов кур.

Методы направленного переноса генов в эмбрионы кур i

Использование вирусных векторов

Перенос рекомбинантной ДНК в эмбрионы посредством

плюрипотентных клеток

Культивирование эмбрионов кур после генноинженерных

манипуляций
Характеристика примордиальных зародышевых клеток ПЗК как вектора для доставки рекомбинантной
Развитие и миграция ПЗК в ранний период эмбриогенеза
Особенности культивирования ПЗК
Методы генетической модификации ПЗК
Перспективы использования трансгенных технологий в
птицеводстве.
Заключение.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Материалы
Объект исследования
Реактивы и оборудование
Работа с культурой клеток
Получение первичной культуры эмбриональных клеток
2.2.2. Культивирование и криоконсервация клеток.
2.2.3. Приготовление фидерных слоев.
2.2.4. Идентификация ПЗК
2.3. Генетическая трансформация ПЗК.
2.3.1. Электропорация.
2.3.2. Ретровирусная трансфекция
2.3.3. Анализ на наличие генной конструкции.
2.4. Введение трансформированных клеток в эмбрион кур i
2.5. Анализ эффективности колонизации донорскими ПЗК гонад
эмбрионовреципиентов.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Изучение факторов, влияющих на эффективность
выделения ПЗК из эмбрионов кур
3.1.1. Влияние способа обработки эмбрионов кур на
эффективность дезагрегации ткани
3.1.2. Влияние возраста эмбрионов кур на эффективность
выделения ПЗК.
3.1.3. Очистка ПЗК кур от других типов клеток.
3.2. Культивирование ПЗК кур
3.3. Генетическая трансформация ПЗК кур.
3.3.1. Трансфекция ПЗК ретровирусными
векторами.
3.3.2. Введение рекомбинантой ДНК в ПЗК электрическим
пробоем.
3.4. Введение ПЗК, подвергшихся трансфекции, в эмбрионы кур
i viv.
3.5. Разработка методических приемов, направленных на
повышение эффективности трансгенеза эмбрионов кур
3.5.1. Влияние инъекции бусульфана на развитие ПЗК кур
3.5.2. Влияние на развитие ПЗК кур предъинкубационной
обработки яиц ультрафиолетом
3.5.3. Влияние дозы вводимых донорских ПЗК на
эффективность генетической трансформации эмбрионов кур
i viv.
4. ОБСУЖДЕНИЕ.
5. ВЫВОДЫ.
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
ЛИТЕРАТУРА


Генетическая модификация сельскохозяйственной птицы рассматривается в качестве приема улучшения генотипа уже существующих пород для придания им устойчивости к различным возбудителям инфекционных заболеваний, улучшения продуктивных показателей, а также получения биореакторов, синтезирующих рекомбинантные белки в клетках яйцевода . ii i. i, . . . Эрнст, Сураева, . Однако несмотря на заметные успехи в области трансгенеза птиц, само создание трансгенных кур представляет сегодня определенную проблему. Особенности воспроизводства и развития кур i, i, значительно снижают эффективность традиционного метода введения экзогенной ДНК в клетки животных микроинъекции, что требует поиска и разработки альтернативных методов направленного переноса генов. Одним из таких направлений, интенсивно развивающихся в последние годы, является разработка методических подходов, связанных с использованием в качестве клетокмишеней для введения рекомбинантной ДНК разных ч ипов плюрипотентных стволовых клеток i . i, , в том числе примордиальных зародышевых клеток ПЗК предшественников высоко дифференцированных половых клеток. Генетическая ч рансформация ПЗК с последующей их трансплантацией в эмбрионы кур i viv рассматривается как перспективный метод целенаправленной генетической модификации гонад и получения трансгешюй птицы. В связи с этим проведение исследований в данном направлении представляется актуальным в рамках разработки высокоэффективных трансгенных технологий с целью их дальнейшего использования в птицеводстве. Цель и задачи исследований. Исходя из выше изложенного, целью диссертационной работы явилось изучение результативности использования примордиальных зародышевых клеток ПЗК как векторов для генетической трансформации эмбрионов кур i viv. Изучить факторы, влияющие на эффективность выделения и поддержания в культуре ПЗК кур. Выполнить генетическую трансформацию ПЗК i vi и i viv. Оптимизировать метод генетической трансформации ПЗК i vi. Ввести трансформированные ПЗК в эмбрионы кур i viv и изучить эффективность колонизации данными клетками гонад эмбрионовреципиентов. Разработать методические приемы, позволяющие повысить эффективность трансгенеза. Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы изучены факторы, влияющие на эффективность выделения и поддержания в культуре ПЗК кур. Впервые дана сравнительная оценка различных методов генетической трансформации данного типа клеток i vi и i viv и выполнено введение трансформированных ПЗК в эмбрионы кур i viv. Впервые изучена эффективность колонизации донорскими ПЗК гонад эмбрионовреципиентов, а также исследовано влияние предъинкубационной обработки эмбрионов и концентрации донорских ПЗК на эффективность трансгенеза. Практическая значимость. Усовершенствован метод выделения ПЗК из эмбрионов кур и оптимизированы условия поддержания в культуре данного типа клеток. Предложен эффективный способ генетической трансформации ПЗК и их введения в эмбрионы кур i viv. Оптимизированы отдельные этапы технологической цепочки генетической модификации гонад эмбрионов кур i viv с эффективностью колонизации введенных трансформированных ПЗК до ,1. Предложен метод предъинкубационной обработки эмбрионов, блокирующий развитие эндогенных ПЗК в гонадах эмбрионовреципиентов. Способ дезагрегации ткани, стадия развития эмбрионов, разделение клеток по адгезии как факторы, влияющие на результативность получения культуры ПЗК кур. Электропорация как результативный способ генетической трансформации ПЗК i vi. Эффективность колонизации донорскими ПЗК гонад эмбрионовреципиентов. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование, СанктПетербург, Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных, Дубровицы, , . Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК 4. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 3 страницах, содержит таблиц, рисунка, 1 схему. Библиорафический список содержит 7 источников, в том числе на иностранных языках.