Генетическая трансформация эмбриональных клеток кур с использованием ретровирусных векторов

• Автор: Тулякова, Анастасия Олеговна
• Шифр специальности: 03.02.07, 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: п. Дубровицы
• Количество страниц: 109 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Особенности эмбрионального развития кур.

Методы трансгенеза в птицеводстве.

Микроииъекция Д1СК в цитоплазму зиготы

Использование вирусных векторов для переноса экзогенной

ДНК в эмбриональные клетки и органы птицы.

Использование эмбриональных стволовых клеток

Использование примордиальных зародышевых клеток

ПЗК для получения трансгенной птицы.

Осеменение самок трансформированными спермиями
Ретровирусные векторы как эффективная система переноса
чужеродных генов в клетки эукариот
Биологические особенности ретровирусов
Создание ретровирусных векторов.
Пакующие линии клеток.
Свойства ретровирусных векторных систем и их использование для генетической модификации
сельскохозяйственной птицы
Применение трансгенных кур
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Материалы.
Реактивы и оборудование.
Генные конструкции
Работа с культурой клеток.
Культивирование клеток
Получение первичной культуры клеток эмбриона курицы.
2.3.3 Трансформация эмбриональных клеток кур i vi
ретровирусными векторами.
2.3.4 Введение ретровирусных векторов в в эмбрионы кур i
2.4. Анализ на наличие генной конструкции
2.5 Анализ экспрессии рекомбинантных белков.
2.5.1 Иммуногистохимия
2.5.2 Оценка экспрессии экзогенной 3галактозидазы.
3, РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Результативность генетической трансформации
эмбриональных клеток кур ретровирусными векторами в культуре i vi
3.2. Изучение факторов, влияющих на результативность
получения трансгенных кур
3.2.. Способ и стадия введения генных конструкций в эмбрионы
3.2.2. Способ подготовки генных конструкций для инъекции и их
концентрация.
3.3. Эффективность использования ретровирусных векторов,
содержащих целевые гены человека, для генетической трансформации эмбрионов кур i viv
3.3.1. Введение в эмбрионы кур генной конструкции рХ
V.
3.3.2. Введение в эмбрионы кур генной конструкции Xi
3.3.3. Анализ эффективности интеграции генных конструкций в
органах и тканях опытных кур.
3.3.4. Анализ экспрессии рекомбинантных белков в органах и
тканях опытных кур.
4. ОБСУЖДЕНИЕ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ ЛИТЕРАТУРА
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


. Сураева . ., . К важным преимуществам данной технологии производства рекомбинатных протеинов по сравнению с созданием животныхбиореакторов следует отнести короткий генерационный интервал сельскохозяйственной птицы, позволяющий получать стадо продуцентов уже через полгода после получения родоначальников для сравнения, получение стада продуцентов крупных сельскохозяйственных животных коров, коз, свиней требует до 35 лет, высокую белоксинтезирующую способность птицы, а также отсутствие патогенной микрофлоры в белке яйца. Вышеназванные преимущества обуславливают относительно невысокую стоимость получаемых рекомбинантных протеинов затраты на производство 1 грамма рекомбинантного белка составляют около центов, в то время как при использовании для этих целей молочной железы трансгенных животных стоимость возрастает до 0 долларов . ., . Однако традиционный метод получения трансгенных животных микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы является малоэффективным для получения трансгенной птицы, что связано, прежде всего, с особенностями ее воспроизводства и развития, а именно с трудностью в точности определения овуляции, большим количеством желтка в яйцеклетке, сильным уплотнением цитоплазмы около пронуклеусов. ДНК, одним из которых является использование векторных систем на основе ретровирусов. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы являлось изучение факторов, влияющих на результативность генетической трансформации эмбриональных клеток кур с использованием ретровирусных векторов. Изучить компетентность эмбриональных клеток кур к рекомбинантным ретровирусным векторам i vi. Определить факторы, влияющие на результативность введения рекомбинантных ретровирусов в эмбриональные клетки кур способ и период введения, концентрация и тип используемого препарата. Изучить результативность генетической трансформации модифицированными ретровирусами эмбрионов кур i viv. Оценить влияние генноинженерных манипуляций на развитие эмбрионов кур. Провести анализ интеграции и экспрессии рекомбинантной ДИК в органах и тканях трансгенных кур. Впервые исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в эмбриональные клетки кур посредством использования ретровирусных векторов, изучено влияние проводимых генноинженерных манипуляций на эмбриогенез кур. Выявлены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации эмбрионов кур i viv. Дана характеристика паттернов интеграции и экспрессии рекомбинантных генов I, инсулин и гормон роста в различных органах и тканях полученной трансгенной птицы. Усовершенствован метод получения трансгенных кур, основанный на использовании ретровирусных векторов. Предложен усовершенствованный способ введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур i viv. Оптимизированы отдельные этапы технологической цепочки создания трансгенной птицы, позволяющей получать трансгенных кур с интеграцией и экспрессией генов инсулина и гормона роста в ряде внутренних органов сердце, печени, кишечнике, желудке, яйцеводе и репродуктивных органах, а также в мышечной ткани. Опосредованный ретровирусами перенос генов как результативный способ генетической трансформации эмбриональных клеток кур i vi и i viv. Способ подготовки, состав инъекционного препарата, стадия введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур i viv как факторы, влияющие на результативность получения трансгенной птицы. Характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в органах и тканях трансгенных кур. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных, Дубровицы, , гг. Актуальные проблемы биологии в животноводстве, Боровск, г. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК 1. Диссертация изложена на 9 страницах, содержит 9 таблиц, рисунка, 9 графиков, 1 схему. Библиографический список содержит 0 источников, в том числе на иностранных языках.