Фенотипическая и генотипическая характеристика мутантов патогенных видов рода Burkholderia с измененной чувствительностью к антибиотикам

• Автор: Молчанова, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Волгоград
• Количество страниц: 127 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1, ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Таксономия и генетическая организация патогенных видов

i

1.2. Патогенные свойства В. i, В. i, В. i

1.3. Резистентность патогенных видов i к антибиоти

кам механизмы формирования аитибиогикорезистентности

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы и питательные среды
2.2. Антибактериальные препараты. Методы оценки чувстви
телыюсти
2.3. Метод направленной селекции
2.4. Химический мутагенез
2.5. Транспозонный мутагенез
2.6. Определение ферментативной активности культур
2.7. Методы анализа белков
2.8. Методы генетического анализа
2.9. Определение вирулентности
2 Статистическая обработка результатов
Глава 3. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ ПАТОГЕННЫХ
БУРКХОЛЬДЕРИЙ С ИЗМЕНЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К АНТИБИОТИКАМ
3.1. Направленная селекция мутантов В. i, В. i, В. i, резистентных к антибиотикам
3.2. Выделение антибиотикочувствитсльных мутантов буркхоль дерий с использованием транспозоиного и химического мутагенеза
Глава 4. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТОВ С ИЗМЕНЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К АНТИБИОТИКАМ
4.1. Перекрестная резистентность к антибиотикам штаммов
В. i, В. i, В. i
4.2. Влияние на уровень аитибиотикорезистентности штаммов
буркхольдерий верапамила блокатора мембранных каналов
4.3. Продукция внеклеточных ферментов штаммами
vi . с измененной чувствительностью к антибиотикам
4.4. Анализ экспрессии мембранных белков мутантов
В. i, В. i, В. i
4.5. Вирулентность резистентных штаммов патогенных бурк
хольдерий
Глава 5. МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТОВ .I, В. I И В. I
5.1. Анализ генетической гетерогенности популяций
исходных и полирезистентных штаммов i .
с использованием метода
5.2. Аллельный полиморфизм генов мажорного порина
орсР1отр у штаммов буркхольдерий с различной чувствительностью к антибиотикам
5.3. Комплементация последовательности орсРотр у мутан тов В. i при трансформационной передаче
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Оценить участие в формировании резистентности механизмов, связанных с проницаемостью наружных мембран изменение уровня антибиотикоустойчивости в присутствии блокатора мембранных каналов и продукции некоторых внеклеточных ферментов. Провести сравнительный анализ продукции компонентов системы мембранного транспорта у мутантов буркхольдерий с различными фенотипами резистентности к антибиотикам. Определить вирулентность мутантов с измененной чувствительностью к антибиотикам для экспериментальных животных и разработать метод ее оценки на модели простейших. Охарактеризовать генетический полиморфизм резистентных мутантов В. В. i, В. , анализа фрагментов ДНК, гомологичных генам интеграз и изучить изменчивость пориновых генов с помощью ЦР. Впервые проведено сравнительное исследование особенностей формирования резистентности к антибиотикам классов фторхинолонов и цефалоспоринов у патогенных филогенетически родственных видов i В. В. i, В. Установлено, что направленно селекционированные мутанты этих микроорганизмов с маркерами резистентности к пефлоксацину, офлоксацину и цефтазидиму, приобретают фенотип множественной устойчивости к препаратам других классов высокого уровня. Приоритетность исследований по получению и изучению резистентных штаммов буркхольдерий данного типа подтверждена патентом на изобретение Инсерционный мутант i i КМ модельный штамм для молекулярногенетического анализа механизмов формирования множественной антибиотикорезистентности у патогенных буркхольдерий заявка XI6 от 5 ноября г. На основании изучения устойчивости к антибиотикам в присутствии блокатора мембранных каналов верапамила и секреции внеклеточных ферментов дана предварительная оценка возможных механизмов формирования множественной резистентности, связанных с процессами проницаемости клеточных мембран. У мутантов всех трех видов i с измененной чувствительностью к антибиотикам проведен сравнительный анализ продукции компонентов системы мембранного транспорта и секреции и обнаружены различия в профилях белков наружных мембран, варьирующие при изменении резистентности к ингибиторам. Для определения вирулентности мутантных штаммов В. В. i, В. i и осуществлено моделирование локального инфекционного процесса феномен Штрауса, вызываемого В. Установлено, что развитие исследуемых типов резистентности или повышенной чувствительности приводит к снижению вирулентности мутантов для данных моделей. Впервые изучен генетический полиморфизм мутантов патогенных видов i с измененной чувствительностью к антибиотикам с использованием метода и проведен анализ изменчивости пориновых генов методом Г1ЦР. Показано, что штаммы В. , образовывали две группы сходства, отдельные от групп, объединяющих транспозонные мутанты ТТМ этого вида, чувствительные к антибиотикам. На основании результатов анализа аллельного полиморфизма пориновых генов орсР1отр, показавшего модификацию их структуры у штаммов В. В. i, высказано предположение о возможной роли полифункциональных поринов ОрсР1Отр в формировании у патогенных буркхольдерий множественной резистентности. Роль порина В. ПЦРпродукта, соответствующего последовательности орсР1отр генов. Получена коллекция мутантов В. В. i, В. Мутанты В. 2 x и В. депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского НИПЧИ Микроб, ГКГГБ с присвоенными номерами В. КМ 7 и В. КМ 6 соответственно. Модель простейших . ВолгоградНИПЧИ при изучении вирулентности и способности к персистированию патогенных буркхольдерий. Материалы диссертационной работы вошли в раздел методических указаний МУК 4. Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сан, мелиоидоз к антибактериальным препаратам, утвержденных Главным санитарным врачом РФ Г. Г. Онищенко 1 апреля г. Полученные методом направленной селекции мутантные штаммы В. В. i, В.