Влияние местной стимуляции врожденного иммунитета липополисахаридом Salmonella typhi на репарацию раневых дефектов кожи

• Автор: Костарной, Алексей Викторович
• Шифр специальности: 03.02.03, 14.03.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Бактериальные липополисахариды структура, распознавание иммунной системой, применение в медицине

1.1.1 Структу ра бактериальных липополисахаридов.

1.1.2 Распознавание ЛПС иммунной системой и процесс передачи сигнала от ТЫ.

1.1.3 Применение препаратов ЛПС в медицине.

1.2 Участие врожденного иммунитета в репаративных процессах.

1.2.1 Стадии раневого процесса.

1.2.2 Участие клеток иммунной системы в репарации ран кожи.

1.2.3 Участие Топодобных рецепторов в процессах репарации.

1.2.4 Участие Топодобных рецепторов в репарации ран кожи.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1 Бактериальные липополисахариды
2.1.2 Клеточные линии
2.1.3. Другие реактивы
2.1.4. Лабораторные животные
2.1.5. Лабораторное оборудование
2.2. Методы
2.2.1. Измерение активности 3галактозидазы в культуре клеток
2.2.2. Иммуноблотинг
2.2.3 ЛАЛтест
2.2.4 Определение уровня секреции 1Ь6, МСР1, М1Р1 при внутримышечном введении ЛПС
2.2.5 Определение ЬО
2.2.6 Электрофорез ЛПС в полиакриламидном геле в присутствии до деци л сульфата натрия или деоксихолата натрия
2.2.7 Кислотный гидролиз ЛПС
2.2.8 Высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ полисахаридов
2.2.9 Определение степени ацилирования липида А методом Iмассспектрометрии
2.2. Приготовление гелей, содержащих ЛПС, для исследований i viv
2.2. Моделирование резаной раны.
2.2. Биомеханические исследования
2.2. Исследование влияния местного нанесения ЛПС на процесс воспаления и инфильтрацию лейкоцитов, процессы колагенообразовапия и эпителизации
2.2. Исследование влияния местного нанесения 1II на ангиогенез и количество фибробластов в области раневого дефекта
2.2. Изготовление гистологических срезов
2.2. Окрашивание гистологических срезов гематоксилин эозином и по Массону
2.2. Иммуногистохимическое окрашивание.
2.2. Гистологическое исследование микропрепаратов
2.2. Схема эксперимента, направленного на полногеномное исследование экспрессии генов в ответ на местное нанесение ЛПС
2.2. Выделение РНК из ткани.
2.2. Полногеномное исследование экспрессии генов
2.2. Изучение кинетики секреции цитокинов, хемокинов и ростовых факторов в области раневого дефекта при нанесении ЛПС
2.2. Выделение белка из ткани
2.2. Иммуноферментный анализ
2.2. Измерение концентрации цитокинов на проточном цитофлуориметре i
2.2. Измерение концентрации цитокинов на флуориметре i x
2.2. Доклинические исследования
2.2. Статистическая обработка
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Сравнительное изучение физикохимических, иммунобиологических и токсикологических свойств липополисахаридов . i Ту2 и . i В
3.2 Определение влияния местного нанесения ЛПС на скорость репарации ран кожи биомеханическим методом
3.3 Исследование влияния местного нанесения ЛПС на репарацию ран на тканевом уровне.
3.3.1 Исследование влияния местного нанесения ЛПС на процесс воспаления и инфильтрацию лейкоцитов.
3.3.2 Исследование влияния местного нанесения ЛПС на процессы коллагенообразования и эпителизации раневых дефектов кожи
З.З.ЗИсследование влияние местного нанесения ЛПС на
ангиогенез и количество фибробластов в области раневого дефекта
3.4 Полногеномное изучение изменения экспрессии генов в области раневого дефекта.
3.5 Изучение кинетики секреции цитокинов, хемокинов и ростовых факторов в области раневого дефекта при нанесении ЛПС.
3.6 Доклиническое изучение безопасности местного накожного применения лекарственного средства, содержащего ЛПС.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Доклиническое изучение безопасности местного накожного применения лекарственного средства, содержащего ЛПС. ГЛАВА 4. Раны различной этиологии, ожоги и язвы кожи и слизистых оболочек являются трудно разрешаемой медикосоциальной проблемой современного общества. Особую актуальность изучение вопросов репарации ран кожного покрова приобретает в связи с постоянным ростом ран различного генеза вследствие ожогов, операций, механических травм. Терапия трофических язв, диабетических рай, пролежней, вялогранулирующих инфицированных ран, требует применения широкого арсенала лекарственных средств в течение длительного времени, во многих случаях вызывает необходимость стационарного лечения и зачастую оказывается недостаточно эффективным. Микробная флора является обязательным участником процесса заживления ран кожи. Полагают, что микроорганизмы, способствуя воспалению и лизису омертвевших тканей, играют важную роль в очищении от них раневого дефекта вместе с тем известно, что контаминация рапы микроорганизмами может отрицательно сказываться на течении раневого процесса 8. В целом, влияние микрофлоры на раневый процесс определяется характером повреждения, вирулентностью и количеством микробов, контаминировавших рану и особенностями иммунной системы макроорганизма . Известно, что ключевую роль в процессах репарации играет система врожденного иммунитета , 3, 9. Паттернраспознающие рецепторы врожденного иммунитета, в отличие от Т и Вклеточных рецепторов адаптивного иммунитета, распознают не уникальные структуры антигенных эпитопов, а высоконсервативныс молекулярные структуры, характерные для микроорганизмов и вирусов i , 2 а также структуры молекул, высвобождаемых или секретируемых в ответ на повреждение ткани i , . В, , 5, 7, АР1, регулирующих секрецию спектра цитокинов, хемокинов, антимикробных пептидов, молекул адгезии и других факторов, которые могут влиять на процесс репарации. Рецепторы врожденного иммунитета в частности подобные рецепторы экспрессируются широким спектром клеток, образующихся или присутствующих в коже фибробластами, адипоцитами, кератиноцитами, эндотелиальными клетками, включая клетки иммунной системы, такие как моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, клетки Лангерганса, тучные клетки, Т и Влимфоциты 7. Важность проведения сигнала через подобные рецепторы для заживления ран была показана с использованием генетически модифицированных животных. Так, у мышей, нокаутных по гену цитозольного белка , необходимого для передачи сигнала от большинства кроме 3 наблюдается значительно худшее заживление ран кожи, ассоциированное с уменьшенным уровнем ангиогенеза раневого дефекта на 8. Репарация ран кожи у мышей, нокаутных по гену 3, замедлена, и ассоциирована с уменьшенным уровнем секреции хемокинов и худшей инфильтрацией нейтрофилов и альтернативно активированных макрофагов в области раневого дефекта 8. Так, i и соавт. Нанесение на раневую поверхность i 1С, лиганда 3, стимулировало ангиогенез, способствовало инфильтрации раны макрофагами и приводило к ускорению репарации 9. Однако к настоящему моменту отсутствуют данные, касающиеся влияния местного применения одного из наиболее активных лигандов , бактериального липополисахарида лиганда 4 на процесс репарации ран кожи. Учитывая, что 4 экспрессирован большинством клеток кожи, известен обширный перечень лигандов этого рецептора, опубликован ряд данных, полученных i vi, показывающих участие этого рецептора в активации фибробластов, эпителиальных клеток, клеток эндотелия сосудов, можно предположить, что местная стимуляция 4 может оказывать существенное влияние на процессы репарации кожи i viv. Цель работы Изучение влияния местной стимуляции врожденного иммунитета бактериальным липополисахаридом ЛПС, лигандом подобного рецептора 4, на репарацию ран кожи. Охарактеризовать физикохимические, иммунобиологические и токсикологические свойства используемого в работе липополисахарида i. Изучить влияние местного нанесения ЛПС . Провести полногеномное изучение изменения экспрессии генов при местном нанесении па раневый дефект бактериального ЛПС .