Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях

• Автор: Игнатова, Ольга Михайловна
• Шифр специальности: 03.02.03, 14.03.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 143 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Иммунобиотехнология профилактических и

терапевтических противостафилококковых препаратов

1.1 Микробиологические аспекты биотехнологии получения стафилококковых вакцин

1.2 Основные факторы патогенности и их роль в противостафилококковом иммунитете

1.3 Современные моно и комплексные противостафилококковые препараты.

Заключение по обзору литературы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования

2.1 Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

2.2 Экспериментальные животные.
2.3 Питательные среды
2.4 Молекулярнобиологический метод выявления гена, ответственного за синтез белка А
2.5 Способы культивирования .
2.6 Получение антигенных препаратов
2.7 Методы химического и физикохимического анализа антигенных препаратов.
2.7.1 Определение белка
2.7.2 Определение углеводов
2.7.3 Определение нуклеиновых кислот.
2.7.4 Хроматомасссиектрометрический анализ.
2.7.5 Вертикальный электрофорез
2.7.6 Гельфильтрация
2.8 Методы иммунохимического анализа антигенных препаратов
2.8.1 Двойная диффузия в геле по Оухтерлони ДДГ
2.8.2 Линейный иммунноэлектрофорез ИЭФ.
2.8.3 Ракетный иммуноэлектрофорез РИЭФ.
2.8.4 Определение специфической активности антигенов в
реакции торможения пассивной гемагглютинации РТПГА.
2.8.5 Иммуноферментный анализ ИФА
2.8.6 Торможение иммуноферментной реакции
2.9 Изучение токсичности и протективной активности антигенных препаратов
2.9.1 Изучение острой токсичности препаратов
2.9.2 Изучение протективной активности препаратов.
2. Определение способности препаратов взаимодействовать с толлподобными рецепторами
2. Определение влияния антигенов на эффекторы врожденного и адаптивного иммунитета мышей и человека.
Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови МЛПК доноров
Получение ДК из МЛПК человека и из костномозговых предшественников костного мозга мышей.
Изучение протективной активности ДК, выделенных из костномозговых предшественников, и стимулированных антигенными препаратами.
Проточная цитометрия анализ.
Иммуноферментный анализ ИФА
Получение суспензии мононуклеарных лейкоцитов МЛ
и лимфоцитов мышей.
Цитотоксический тест.
Культивирование клеток К2
Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов и
ДК по поглотительной способности.
2. Методы статистической обработки полученных результатов
ГЛАВА 3. Получение антигенных препаратов при различных способах культивирования штаммов . и их химическая и иммунобиологическая характеристика.
3.1 Выявление в вакцинных штаммах . гена, ответственного
за синтез белка .
3.2 Исследование продуктивности процессов периодического выращивания . в различных питательных средах и условиях культивирования
3.3 Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов . , при различных условиях их культивирования.
3.4 Иммунохимическис свойства антигенных препаратов, полученных при различных условиях выращивания вакцинных штаммов . .
3.5 Острая токсичность антигенных препаратов
Заключение по главе 3.
ГЛАВА 4. Изучение молекулярноклеточных механизмов действия антигенных препаратов на ключевые клетки эффекторы врожденного иммунитета и активацию адаптивного иммунитета.
4.1 Действие антигенных препаратов на эффекторные клетки врожденного иммунитета
4.1.1 Формирование ДК иод воздействием антигенных препаратов
4.1.1.1 Морфологическая характеристика ДК на разных этапах созревания под воздействием антигенных препаратов
4.1.1.2 Характеристика иммунофенотипа ДК, полученных при использовании в качестве индуктора созревания антигенных препаратов
4.1.1.3 Характеристика профиля и уровня цитокинов, продуцируемых созревшими ДК.
4.1.2 Влияние антигенных препаратов на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей.
4.1.3 Влияние антигенных препаратов на активность естественных киллеров МЛ селезенок мышей и МЛПК доноров
4.1.4 Взаимодействие стафилококковых антигенных препаратов с толлподобными рецепторами.
4.1.5 Изучение уровня цитокинов в сыворотках иммунизированных мышей
4.2 Действие антигенных препаратов на формирование системы адаптивного иммунитета.
4.2.1 Изучение субпопуляционной структуры лимфоцитов у мышей под воздействием стафилококковых антигенных препаратов
4.2.2 Изучение синтеза специфических антител в сыворотках мышей, иммунизированных стафилококковыми антигенными препаратами.
4.2.3 Использование дендритных клеток для создания специфической защиты от стафилококковой инфекции
4.2.4 Изучение протективной активности антигеных препаратов
Заключение по главе 4.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


До настоящего времени антигенные препараты стафилококка, входящие в бесклеточную стафилококковую вакцину и в ИммуновакВП4, получали при культивировании штаммов на плотной питательной среде и инактивировании ацетоном смытой с поверхности агара биомассы с последующим ее отделением методом центрифугирования, что представляет трудоемкий, малопроизводительный и дорогостоящий процесс. Использование реакторного культивирования в жидких питательных средах с последующим отделением биомассы методом микрофильтрации устраняет эти недостатки. Так как стафилококковый компонент является довольно лабильным, возникает необходимость определения возможного влияния технологических изменений на свойства антигенных препаратов, приготовленных из культур, выращенных при периодическом реакторном культивировании. Достижения иммунологии на современном этапе 0, 9 позволяют охарактеризовать полученные антигенные препараты не только по их иммуногенности, но и на молекулярноклеточном уровне по их действию на ключевые эффекторы врожднного и адаптивного иммунитета. Если для препарата ИммуновакВП4 такое исследование проведено 3, 4, то в отношении стафилококкового компонента подобных данных нет. Цель исследования получение антигенных препаратов из вакцинных штаммов . Охарактеризовать вакцинные штаммы . Изучить накопление биомассы вакцинных штаммов . Провести исследование антигенных препаратов, полученных при разных способах выращивания . Исследовать влияние антигенных препаратов . Изучить действие антигенных препаратов на систему адаптивного иммунитета продукция специфических антител, протективная активность. Впервые исследованы вакцинные штаммы . А, и установлено его присутствие только в штамме 5. Наиболее иммуногенные вакцинные штаммы и обладали внутривидовой антигенной активностью способствовали образованию в сыворотках иммунизированных мышей высокого уровня Iантител. Антигенные препараты, полученные из культур, выращенных в условиях периодического реакторного культивирования и на плотной среде, обладали сопоставимой специфической антигенной активностью, включали полисахаридсодержащие компоненты, общие с поверхностным полисахаридом и тейхоевыми кислотами . Показано, что антигенные препараты, полученные из вакцинных штаммов . Обоснована возможность применения способа периодического реакторного культивирования вакцинных штаммов . Результаты использованы при разработке производственной технологии реакторного культивирования вакцинных штаммов . ИммуновакВП4. Среди исследованных вакцинных штаммов . А. Наиболее иммуногенные штаммы и не, содержат этот ген. Антигенный препарат, полученный из биомассы вакцинных штаммов . Препараты сопоставимы по специфической антигенной активности, включают полисахаридсодержащие компоненты, общие с поверхностным полисахаридом и тейхоевыми кислотами стафилококковых препаратов сравнения. ТЬЯ2 на модели эмбриональных клеток почки человека, усиливают экспрессию про, противовоспалительных и регуляторных цитокинов. Установлена способность стафилококковых препаратов активировать адаптивный иммунитет с индукцией высокого уровня вантител и повышением численности активированных Т и В лимфоцитов. Дендритные клетки, созревшие под влиянием антигенных препаратов, приобретали способность представлять антиген Т лимфоцитам и защищать мышей от стафилококковой инфекции. На примере препарата, полученного при реакторном культивировании, показана протективная активность в отношении стафилококковой инфекции у мышей. ГЛАВА 1. Стафилококковая инфекция одна из важнейших проблем медицинской практики, поскольку является этиологическим фактором пиодермий, занимающих ведущее место в структуре кожной патологии, и различных гнойновоспалительных заболеваний других органов и систем человека. Большую проблему представляют метициллинрезистентные штаммы . России превышает , что создат крайне серьзные проблемы для терапии , . Резистентность стафилококковых штаммов к метициллину результат продукции изменнных иенициллинсвязывающих белков РВР2а, которые менее аффинны для большинства рлактамных антибиотиков. Этот белок локализуется на мембраносвязанной поверхности клетки и очень важен для биогенеза клеточной стенки, являясь медиатором перекрстных связей нептидогликана 8. О резистентности к ванкомицину ранее сообщалось только в отношении энтерококков 6, затем она была отмечена и у .