Получение in vitro трехмерных трансплантатов костной ткани на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга и их использование при повреждении костной ткани

• Автор: Кульнева, Екатерина Игоревна
• Шифр специальности: 03.01.06, 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.

Введение

1 Обзор литературы.

1.1 Материалы, используемые для восстановления костной ткани

1.1.1 Ауто, алло и ксенотрансплантаты

1.1.2 Синтетические матриксы.

1.2 Мультипотентные мезенхимные стромалытые клетки перспективный материал для тканевой инженерии костной ткани

1.2.1 Морфология ММСК

1.2.2 Иммунофенотип ММСК.

1.2.3 Иммунологические свойства ММСК.

1.2.4 Потенциал ММСК к направленной цитодифференцировке
1.3 Тканевая инженерия костной ткани.
1.4 Современные подходы к восстановлению костных дефектов
1.5 Заключение.
2. Собственные исследования
2.1 Материалы и методы исследований
2.1.1 Материалы исследований.
2.1.2 Методы исследований
2.2 Результаты исследований
2.2.1 Характеристика ММСК, выделенных из костного мозга и подкожножировой клетчатки человека
2.2.2 Сравнение остеогенного потенциала ММСК, выделенных из костного мозга и подкожножировой клетчатки чловека
2.2.3 Характеристика ММСК костного мозга овцы
2.2.4 Определение митотического индекса и времени цигогенерации популяции ММСК костного мозга овцы i vi.
2.2.5 Анализ экспрессии поверхностных маркеров полученной популяции ММСК костного мозга овцы
2.2.6 Направленная дифференцировка ММСК костного мозга овцы
2.2.7 Подбор среды для адгаюгенной дифференцировки ММСК костного мозга овцы
2.2.8 Получение i vi трехмерного трансплантата костной ткани на основе ММСК костного мозга и кальцийфосфатного матрикса
2.2.9 Влияние полученных i vi трехмерных трансплантатов костной ткани на организм овец при остеосинтезе.
3. Обсуждение результатов исследований
4. Выводы
5. Практическое использование результатов исследований.
6. Рекомендации по использованию научных выводов.
7. Список использованной литературы
Приложения.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ММСК КМ мультипотентные мезенхимные стромальные клетки костного мозга
ММСК ПЖК мультипотентные мезенхимные стромальные клетки
подкожножировой клетчатки
ТТКТ трехмерные трансплантаты костной ткани
ДКМ деминерализованный костный мтарикс
КМБ костные морфогенетические белки
ГА гидроксиапатит
ОТПЦР полимеразная цепная реакция с применением стадии обратной транскрипции
ФСБ фосфатносолевой буфер Дюльбекко
ДК дендритные клетки
клетки клетки естественные киллеры
кластер дифференцировки
трансформирующий фактор роста бега
сыворотка плодов коров
I интерлейкин
рецептор эендотелиального фаткора роста
I молекула межклеточной адгезии
РЕСАМ молекула адгезии тромбоцитэндотелиальной клетки
I интерфером гамма
фактор некроза опухоли
фактор роста тромбоцитов
V молекулы адгезии сосудистого эндотелия
лимфоцитарный функциональный антиген
молекула адгезии активированных лейкоцитов
1 киназа фетальной печени
1 антиген стволовых клеток 1 v фактор фактор Виллебранда
МНС молекулы главного комплекса гистосовместимости
человеческий лейкоцитарный антиген
овечий лейкоцитарный антиген
фактор роста гепатоцитов
2 простагландин Е
X СХС хемокиновые рецепторы
СС хемокиновый рецептор
рецепторы, активирующие пролиферацию пероксисом гамма
липоиротеиновая липаза
зеленый флуоресцентный белок
среда Игла в модификации Дюльбекко с пониженным содержанием глюкозы
среда Игла в модификации Дюльбекоо с высоким содержанием глюкозы
диметилсульфоксид
человеческий сывороточный альбумин
I1 инсулиноподобный фактор роста
ГАФДГ глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназа
МИ митотический индекс
КСП костный сиалопротеин
ОК остеокальцин
ОП остеопонтин
эмбриональный антиген специфичной стадии
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Охарактеризовать клетки, выделенные из костного мозга овцы, с фенотипом подобным ММСК. Провести анализ потенций ММСК костного мозга овцы к направленной дифференцировке i vi. Оптимизировать среду для направленной дифференцировки ММСК костного мозга овцы i vi. Оптимизировать сущеегвующий способ за1рузки ММСК в кальцийфосфатный матрикс для создания трехмерных трансплантатов костной ткани i vi. Провести доклиническое изучение полученных трансплантатов костной ткани на овцах баранах. Научная новизна. Впервые охарактеризованы морфологические и иммунобиологические свойства ММСК, выделенных из костного мозга овцы. Впервые изучены потенции ММСК КМ овцы к остеогенной 0,, хондрогенной 0,2 и адипогениой 0,2 дифференцировке. Подобрана оптимальная среда для направленной адипогениой дифферснцировки. Впервые разработан метод эффективного ,, заселения пористых трехмерных кальцийфосфатных матриксов клеточным материалом, которые могут быть использованы для восстановления костных дефектов критической величины. Определена оптимальная скорость орбитального шейкера для более эффективного заполнения пористого матрикса клетками. Доказано, что в результате i vi культивирования ММСК костного мозга в матриксе в среде с добавлением индукторов остеогенной дифференцировки, получены трехмерные биологические структуры костной ткани. Впервые в России проведены доклинические испытания, полученных i vi костных трансплантатов, по восстановлению костной ткани i viv. В качестве модели дефекта костной ткани критической величины использовались бараны с двойной остеотомией большеберцовой кости. Получены данные о влиянии трехмерных трансплантатов костной ткани на основе ММСК костного мозга на организм овцы. Практическая значимость. Разработанный метод получения эффективных трехмерных трансплантатов костной ткани представляет практический интерес для биотехнологии, медицины и ветеринарии, поскольку позволяет получить эффективный биологический эквивалент костной ткани при относительной низкой стоимости его изготовления. На базе ООО Быоти Плаза налажено создание трехмерных трансплантатов костной ткани в производственных масштабах. Разработан метод эффективной загрузки трехмерных кальцийфосфатных матриксов ММСК КМ для создания ТТКТ с эффективностью ,9 0,. Проведены доклинические испытания полученных ТТКТ на овцах. Метод получения и наращивания ММСК костной ткани овцы используется на кафедре иммунологии, а способ имплантации ТТКТ используется на кафедре хирургии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научноисследовательской работе и учебном процессе. Полученные биотрансплантаты костной ткани используются в ФГУ ЦИТО им. Приорова Минздравсоцразвития России для клинического изучения. На базе ООО Бьюти Плаза создан Национальный банк стволовых клеток, с целью криоконсервации ММСК КМ для создания ТТКТ и их дальнейшего научного и клинического применения. Личный вклад соискателя. Были сделаны выводы и даны рекомендации по дальнейшему применению разработанной технологии. Доклиническое испытание было выполнено совместно с аспирантом кафедры иммунологии Девришовым В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве со старшим научным сотрудником Центра клеточных технологий ООО Бьюти Плаза, канд. Коржиковой С. Апробация результатов диссертации. Италия, , на Всероссийской школеконференции для молодых ученых Стволовые клетки и регенеративная медицина Москва, . Публикации. По результатам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, российских и зарубежных изданий, а так же 5 статей в сборниках научных трудов. Объем и структура диссертации. Работа иллюстрируется 6ю таблицами, мя рисунками и содержит 6 страниц приложений. На защиту выносятся следующие положения и результаты. Выбор наиболее оптимального клеточного материала для создания трехмерных трансплантатов костной ткани и его характеристика. Характеристика ММСК костного мозга овцы. Усовершенствованный метод заселения ММСК кальцийфосфатного матрикса. Доклиническое изучение полученных биологических эквивалентов костной ткани в организме овец.