Разработка биотехнологических аспектов повышения иммуногенности вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ

• Автор: Голова, Алина Борисовна
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 200 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Характеристика профилакгических. противочумных

препаратов
1.1. Противочумные вакцины классификация, основные принципы разработки, антигенная композиция профилактических препаратов, эффективность практического применения
1.2. Методы культивирования вакцинных штаммов для приготовления противочумных профилактических препаратов.

1.3. Особенности режима выращивания аттенуированного штамма

ЕУ НИИЭГ в биотехнологии производства живой чумной вакцины ГЛАВА 2. Антигены чумного микроба и особенности иммуно и

патогенеза чумы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. Объект, материалы и методы исследований
3.1. Бактериальные штаммы и биотехнологические режимы их экспериментального выращивания
3.2. Реактивы и растворы
3.3. Оборудование и приборы.
3.4. Методы изучения влияния биотехнологических режимов выращивания на биосинтез и иммунореактивность основных иммуногенов, а также антигенную композицию бактерий У. реьй.
3.4.1. Влияние экспериментальных биотехнологических режимов выращивания на продукцию вакцинным штаммом ЕУ НИИЭГ основных антигенов с иммуногенной активностью.
3.4.2. Изучение влияния биотехнологических условий выращивания на антигенную активность бактерий У. реь7.
3.4.3. Изучение влияния биотехнологических режимов выращивания на антигенную композицию и иммунореактив
ность бактерий . i методом иммуноблоттинга.
3.5. Методы оценки влияния биотехнологических условий экспериментального выращивания на основные фенотипические характеристики вакцинного штамма V НИИЭГ.
3.5.1. Определение фибринолитической активности
3.5.2. Определение фосфолипазной активности
3.5.3. Определение капсулы.
3.6. Электрофорез.
3.7. Лабораторные животные
3.8. Статистические методы
ГЛАВА 4. Разработка оптимального технологического режима выращивания
i vi бактерий экспериментальнопроизводственного вакцинного штамма V НИИЭГ и его изогенных производных
4.1. Оптимизация режима выращивания бактерий вакцинног о штамма V НИИЭГ i vi для увеличения микробной биомассы.
4.2. Сравнительная оценка пролиферативной активности бактерий изогенных производных вакцинного штамма V НИИЭГ при выращивании на регламентированных
и экспериментальных питательных средах
ГЛАВА 5. Изучение и иммунохимическая характеристика биосинтеза
основных специфических антигенов вакцинным штаммом
V НИИЭГ, выращенным в различных биотехнологических режимах.
5.1. Изучение капсулообразующей, фосфолипазной и фибринолитической активностей бактерий вакцинного штамма V
НИИЭГ, выращенных в различных биотехнологических режимах
5.1.1. Изучение каисулообразования
5.1.2. Изучение фосфолипазной активности
5.1.3. Изучение фибринолитической активности.
5.2. Изучение влияния режима выращивания на биосинтез основных антигенов, обеспечивающих иммуногенные и специфические свойства бактерий вакцинного штамма
ЕУ НИИЭГ, с применением гибридомной биотехнологии
5.3. Изучение влияния режима выращивания на биосинтез и иммунореактивность антигенов вакцинного штамма ЕУ НИИЭГ
углеводной природы
ГЛАВА 6. Разработка эффективной антигенной композиции вакцинного штамма ЕУ НИИЭГ
6.1. Сравнительный анализ иммуногенности вакцинного штамма ЕУ НИИЭГ, выращенного в различных биотехнологических режимах лабораторные испытания.
6.2. Сравнительное изучение иммунореактивности вакцинного штамма ЕУ НИИЭГ, выращенного в различных
биотехнологических режимах
6.3. Иммунохимическая характеристика антигенной композиции вакцинного штамма ЕУ НИИЭГ в зависимости от биотехнологиического режима выращивания бактерий
Заключение
Выводы.
Список использованных литературных источников.
Список принятых в работе сокращений
2,2азиноди3этилбснзтиазолин сульфонат
бычий сывороточный альбумин
I, Ф1 капсульный антиген чумного микроба
I иммуноглобулины класса А
I иммуноглобулины класса
фосфатносолевой буферный раствор
Р1а активатор плазминогена
рН6 антиген чумного микроба
I среда для культур клеток и тканей от англ. i Ii i
,, тетраметилэтилендиамин , мышиный токсин
АКМШ аппарат для культивирования микроорганизмов Шестеренко БВМ белки внешней мембраны БХ бульон Хоттингера
ВОЗ Всемирная Организация Здравоохранения
ГК гидролизат казеина
ГХ гидролизат Хоттингера
ДАБ диаминобензидин
ДИА ДОТ иммуноферментный анализ
ЖЧВ живая чумная вакцина
кДа килодальтон
липоолигосахарид
ЛПС липополисахарид
м.м. молекулярная масса
МКА моноклональные антитела
мкл микролитр
мМ миллимоль
МсА моноспецифические антитела
НЦМ нитроцеллюлозная мембрана ОСА основной соматический антиген
ПААГ8 или Э8РАОЕ электрофорез в полиакриламидном геле в
присутствии додецилсульфата натрия
ТИФА твердофазный иммуноферментный анализ
ЧДИ чумные диагностические иммуноглобулины
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Очевидно, что в начале прошлого века сведений о специфических протективных чумных антигенах было мало, поэтому состав предложенных в тот период экспериментальных вакцин определить было бы сложно. В г. Колле разработал свой метод приготовления вакцин из убитых агаровых культур. Его вакцина предохраняла некоторую часть вакцинированных животных от заражения чумой , , Отген, . Указанные типы убитых вакцин бульонная и агаровая были в дальнейшем усовершенствованы рядом исследователей. Культуры предлагалось убивать не только нагреванием, но и добавлением слабых концентраций дезинфицирующих веществ фенол, формалин, глицерин, которые в меньшей степени повреждают антигены чумного микроба. Митин С. В. использовал метод Зильбера Л. А. умерщвление чумного микроба в присутствии концентрированного раствора сахарозы для предотвращения денатурации бактерийного протеина АДвакцина. Минервин С. М., Ступницкий 1I и Тинкер И. Горохов В. И. предложил формалиновую вакцину. Чтобы повысить эффективность убитых вакцин, были разработаны депонированные вакцины липовакцины. Наряду с корпускулярными вакцинами, для профилактики чумы были рекомендованы дериваты бактериальной клетки. Сюда следует отнести эндотоксины по Безредка А. М. г. V, , нуклеопротеиды по Люстигу Р. Галеоти О. I Курочи К. Хомма Н. Кроме того, были предложены разные вакцины из фаголизатов. Такие препараты оказывали предохранительное действие после троекратных прививок вакциной от небольшой заражающей дозы вирулентной культуры , ii, . Американскими учеными была разработана убитая чумная вакцина , которая состояла из убитых формальдегидом микробов вирулентного штамма . Р i, ii, . Отличительной особенностью штамма считали повышенную продукцию капсульного антигена Ф1 v, , . Вакцина была лицензирована и выпускалась с по гг. Основным недостатком вакцины считали ее сходную с вакциной Хавкина способность защищать только от бубонной, но не от легочной чумы, а также сложную схему вакцинации и значительное количество поствакцинальных осложнений, изза которых она и была снята с производства. В то же время аналогичная чумная вакцина из вышеназванного штамма производится в Австралии и лицензирована для клинического применения внутри страны. Вакцину вводят двукратно с интервалом от 1 до 4 недель с последующей через 6 месяцев бустерной прививкой ii , . Несмотря на определенные успехи, иммунитет к чуме, создаваемый данными убитыми чумными вакцинами рядом исследователей считался относительным, так как приводились сведения, что вакцинированные также заболевали чумой, хотя и реже, чем невакцинированные люди Коробкова, . История живых вакцин началась уже вскоре после открытия возбудителя чумы, когда Иерсен А. Следующей вехой в создании живых чумных вакцин считают эксперименты Стронга П. МаУ. Первоначально прививки были сделаны на Филиппинах в г. ЖуковВережников, . Однако достоверно оценить эффективность вакцинации не удалось ввиду отсутствия в последующие годы эпидемий чумы. Дальнейшего распространения иммунизация этой живой чумной вакциной не получила, так как у учных того времени не было уверенности в необратимости утерянной патогеном вирулентности Книрель с соавт. В Советском Союзе разработку живой противочумной вакцины связывают с рядом известных ученых. Так, Покровская М. П. путем воздействия бактериофага на вирулентную культуру К реэНв выделила штамм АМП, по своим свойствам близкий к гладким вариантам чумного микроба. ЖуковВережников П. Н. и Хворостухина М. М. из авирулентной культуры чумного микроба иод воздействием бактериофага получили культуру ЖВ живой вакцины в шероховатой форме, которую и применили в качестве живой вакцины ЖуковВережников, . Коробкова Е. И. путем воздействия бактериофага на старую музейную культуру , выделила авирулентный штамм 5, который она испытывала как вакцинный. Живые вакцины АМП, ЖВ, 8, также как и вакцина , изученные сотрудниками института Микроб, не получили широкого применения на практике. В зарубежных странах одновременно с отечественными микробиологами над созданием живой противочумной вакцины работали и другие специалисты. Больших успехов добился Оттен Л.