Гидролитические ферменты и их белковые ингибиторы как компоненты взаимодействия картофеля с колорадским жуком

• Автор: Цветков, Вячеслав Олегович
• Шифр специальности: 03.01.05, 03.02.08
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 117 с. : ил.

Содержание
Введение
1. Распространение и свойства гидролитических ферментов организмовфитофагов и их ингибиторов из растений обзор литературы.

1.1. Протеолитические ферменты и их ингибиторы

1.2. Целлюлолитические ферменты и их ингибиторы

1.3. Пектолитические ферменты и их ингибиторы

1.4. Амилолитические ферменты и их ингибиторы

1.5. Физиологическая роль гидролаз и их ингибиторов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования

2.2. Материалы и реактивы

2.3. Методы исследования.
2.3.1. Синтез аффинного сорбента.
2.3.2. Аффинное выделение ферментов
2.3.3. Определение концентрации белка
2.3.4. Определение активности протеаз
2.3.5. Определение активности ферментов методом агарозных гелевых пластин
2.3.6. Определение параметров условий функционирования ферментов значений и температуры среды
2.3.7. Определение активности ингибиторов трипсина по БАПНА
2.3.8. Разделение гидролаз и их ингибиторов методом двумерного электрофореза
2.3.9. Математическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Выделение и характеристика гидролитических ферментов личинок колорадского жука
3.1.1.1 олучение аффинного сорбента на основе полиакриламида и разработка методов выделения гидролитических ферментов и их белковых ингибиторов.
3.1.2. Выделение и характеристика протеолитических ферментов.
3.1.3. Выделение и характеристика целлюлолитических ферментов
3.1.4. Выделение и характеристика пектолитических ферментов
3.1.5. Выделение и характеристика амилолитических ферментов
3.2. Выделение и характеристика ингибиторов гидролаз колорадского жука из листьев картофеля.
3.2.1. Выделение и характеристика ингибиторов протеаз
3.2.2. Выделение и характеристика ингибиторов целлюлаз.
3.2.3. Выделение и характеристика ингибиторов псктиназ.
3.2.4. Выделение и характеристика ингибиторов амилаз.
3.3. Активность и молекулярная гетерогенность гидролитических ферментов колорадского жука в различных условиях обитания.
3.3.1. Влияние кормового субстрата на активность и молекулярный состав гидролитических ферментов личинок колорадского жука
3.3.2. Активность гидролитических ферментов колорадского жука, обитающего на различных территориях.
3.4. Активность ингибиторов гидролитических ферментов в тканях картофеля различных сортов
3.5. Влияние препаратовбиорегуляторов на активность ингибиторов
экзогенных гидролаз в клубнях картофеля
ВЫВОДЫ.
Список использованной литературы


Цистеиновые протеазы играют важную роль в расщеплении растительной пищи у широкого круга жесткокрылых насекомых различных семейств . . Показано, что они хорошо ингибируются как синтетическими, так и природными ингибиторами. Как правило, они локализованы в полости среднего кишечника насекомых, оптимум ферментативной активности обычно находится в пределах 57 у большинства насекомых . Химотрипсинподобная протеиназа колорадского жука имеет оптимум активности при 5. vi, , , . Да, также имеется минорный компонент с молекулярной массой около 0 кДа. Нужно отметить, что оптимум ферментативной активности сходных протеаз сильно различается у разных видов насекомых, в частности, известны сериновые протеазы чешуекрылых с оптимумом активности в щелочной области около 9. Кроме того, в пищеварительной системе личинок колорадского жука обнаружены экзопептидазы протеазы, подобные карбоксипептидазе А и лейциновой аминопептидазе. Последние локализованы в эпителиальной ткани, в отличие от большинства пищеварительных протеаз, находящихся в полости кишечника. Сравнительно плохо изучены аспартильные пищеварительные протеазы насекомых. Большинство из них имеют оптимум протеолитической активности в кислой области около 35 , , . Хотя основную роль в расщеплении растительных белков в кишечнике колорадского жука играют цистеиновые протеазы, ингибирование аспартильных протеаз серьезно затрудняет пищеварение, что говорит о важности первоначального этапа расщепления белков и аспартильных протеаз, осуществляющих его . Известно, что выделение протеолитических ферментов в полость кишечника насекомого зависит не столько от количества пищи, сколько от состава белков в ней. В выделении протеаз задействовано как непосредственное воздействие белков пищи на эпителиальные клетки средней кишки, так и гормональные эффекты, связанные с поступлением пищи в организм i . Ферменты образуются в клетках кишечника в мембранносвязанной форме и накапливаются в везикулах, которые, в свою очередь, связываются со структурами цитоскелета. Ферменты выделяются эпителиальными клетками в форме особых комплексов ii . i, . Известно, что при повреждении листьев томата и картофеля колорадским жуком в растениях наблюдается резкое повышение содержания ингибиторов трипсина и химотрипсина, при длительном повреждении синтезируются также и ингибиторы цистеиновых и аспартильных протеиназ Валуева, Мосолов, . При этом отмечено, что содержание ингибиторов повышается не только в непосредственно поврежденных органах, но и в других частях растения, хотя и в меньшей степени. Повышение содержания ингибиторов протеаз в растении происходит, как правило, не за счет увеличения концентрации конститутивных соединений, а за счет синтеза специальных форм ингибиторов . Данные формы, образующиеся в ответ на стресс, обладают значительно более высокой специфичностью к протеазам иасекомоговредителя, чем ингибиторы, постоянно присутствующие в тканях растения. В настоящее время известно значительное количество ингибиторов протеаз из разных видов растений. Они составляют около семейств, различающихся аминокислотной последовательностью и специфичностью к тому или иному классу протеаз , i, . Так, выделяют ингибиторы сериновых, цистеиновых, аспартильных и металлопротеаз , , . Достаточно детально изучена роль ингибиторов сериновых протеаз как компонентов защитной системы растений. При этом ферменты данного типа в самих растениях являются преобладающим типом протеаз. Тем не мснсс, поскольку они используются растением преимущественно для мобилизации запасных белков в специализированных тканях, присутствие в растении значительных количеств специфичных к ним ингибиторов не сказывается скольконибудь значимо на активности эндогенных протеаз растения в то время как, например, у млекопитающих эндогенные ингибиторы сериновых протеаз выполняют регуляторную функцию в пищеварительных тканях и органах Vi .