Разработка и применение мономерных красных флуоресцентных белков с большим стоксовым сдвигом

• Автор: Петкевич, Кирилл Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурные свойства СЕРподобных красных флуоресцентных белков

1.1.1. Кристаллическая структура флуоресцентных белков.

1.1.2. Структура и образование хромофора.

1.2. Физикохимические свойства красных флуоресцентных белков.

1.2.1. Источники флуоресцентных белков и хромопротеинов

1.2.2. Агрегация.

1.2.3. Олигомеризация

1.2.4. Созревание фолдииг белка и образование хромофора.

1.2.5. Фотостабильность

1.2.6. рНустойчивость флуоресценции.
1.3. Улучшенные мономерные красные флуоресцентные белки.
1.4. Фотофизика и фотохимии флуоресцентных
белков с большим Стоксовым сдвигом
1.5. Применение красных флуоресцентных белков.
1.5.1. Красные флуоресцентные белки как репортерные маркеры
1.5.2. Методы, основанные на индуктивнорезонансном переносе энергии.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Олигодезоксирибонуклеотиды, которые использовались
для ПЦР
2.1.3. Буферные растворы.
2.1.4. Питательные среды для микробиологических исследований.
2.1.5. Среды для клеточной биологии
2.2. Методы молекулярной биологии.
2.2.1. Амплификация генов
2.2.2. Гидролиз ДНК эндонуклеазой рестрикции.
2.2.3. Лигирование.
2.2.4. Трансформация бактерий
2.2.5. Выделение плазмид.
2.2.6. Определение нуклеотидной последовательности.
2.2.7. Мутагенез со случайными заменами
2.2.8. Направленный мутагенез
2.2.9. Электрофорез в агарозном геле.
2.2 Скринирование библиотек мутантов.
2.2 Конструирование плазмид для клеток млекопитающих.
2.3. Выделение и характеризация рекомбинантных ПРв
2.3.1. Выделение и очистка белков
2.3.2. Электрофорез белков.
2.3.3. Определение основных характеристик рекомбинантных белков
2.3.4. Кристаллизация белков БЭБтКаю и ТтКас2.
2.3.5. Сбор данных рентгеновской дифракции, решение
и уточнение кристаллических структур.
2.4. Методы клеточной биологии
2.4.1. Культивация и трансфекция клеток линии НеЬа.
2.4.2. Культивация и трансфекция клеток линий МТЬпЗ,
М ГЬпЗ со сверхэксирессией ЕгЬВ и МОАМВ1
2.4.3. Получения клеточных линий стабильно
эксперссирующих флуоресцентные белки.
2.4.4. Трансплантация раковых клеток в молочную железу ТКИД мышей
2.5. Флуоресцентная микроскопия.
2.5.1. Микроскопия бактериальных колоний.
2.5.2. Флуоресцентная микроскопия животных клеток
2.5.3. Флуоресцентная микроскопия животных клеток в
культуре в режиме реального времени
2.5.4. Прижизненная двухфотонная микроскопия миграции
раковых клеток в опухоли.
2.5.5. Анализ поляризации пар ядрокомплекс Гольджи в клетках опухоли
2.6. Общая схема создания новых красных БР
2.6.1. Стратегия направленной молекулярной эволюции.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Создание красных флуоресцентных белков
с большим Стоксовым сдвигом.
3.2. Основные физикохимические характеристики
очищенных белков ЬтКас1 и ЫтКа1е2
3.3. Кристаллическая структура белков Ь8шКа1с1 и ЬтКа1с2.
3.4. Микроокружение хромофоров в белках ЬтКаГе1 и ЫЖтКайЯ.
3.5. Зависимость спектральных свойств белков
ЬгаКа1с1 п ЬтКак2 от
3.6. Температу рные и изотопные эффекты
в белках ЬтКа1с1 и ЬтКа1с2
3.7. Конверсии стандартных флуоресцентных белков
во флуоресцентные белки с большим Стоксовым СДВИГОМ.
3.8. Характеризации белков ЬтКай.Т и ЬтКа1с2 в живых клетках
3.9. Многоцветная двухфотонная микроскопия в живых мышах
4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Характеристики красных ЕРч ЬтКа1е1 н ЬтКа1е2.
4.2. Зависимость спектральных свойств белков
ЬтКае1 и ЬшКа1с2 от .
4.3. Предполагаемый фотоцикл для белков ЬЯБшКаСе.
4.4. Свойства мутантных белков с большим Стоксовым
сдвигом, полученных из стандартных ЕРч.
4.5. Многоцветная двухфотонная микроскопия в живых мышах.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Кристаллическая структура флуоресцентных белков. Структура и образование хромофора. Физикохимические свойства красных флуоресцентных белков. Агрегация. Созревание фолдииг белка и образование хромофора. Нустойчивость флуоресценции. Улучшенные мономерные красные флуоресцентные белки. Применение красных флуоресцентных белков. Методы, основанные на индуктивнорезонансном переносе энергии. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Буферные растворы. Питательные среды для микробиологических исследований. Методы молекулярной биологии. Гидролиз ДНК эндонуклеазой рестрикции. Лигирование. Выделение плазмид. Определение нуклеотидной последовательности. Электрофорез в агарозном геле. Скринирование библиотек мутантов. Конструирование плазмид для клеток млекопитающих. Электрофорез белков. Кристаллизация белков БЭБтКаю ТтКас2. Культивация и трансфекция клеток линии НеЬа. Флуоресцентная микроскопия. Микроскопия бактериальных колоний. Стратегия направленной молекулярной эволюции. Стоксовым сдвигом. Кристаллическая структура белков Ь8шКа1с1 и ЬтКа1с2. Микроокружение хромофоров в белках ЬтКаГе1 и ЫЖтКайЯ. Стоксовым СДВИГОМ. Характеризации белков ЬтКай. Характеристики красных ЕРч ЬтКа1е1 н ЬтКа1е2. ЬтКае1 и ЬшКа1с2 от . Предполагаемый фотоцикл для белков ЬЯБшКаСе. ЕРч. Многоцветная двухфотонная микроскопия в живых мышах. ВЫВОДЫ. ЛИТЕРАТУРА. Актуальность темы. В последнее десятилетие одним из наиболее приоритетных методов исследований в биологии и медицине стала визуализация различных процессов, происходящих в живых организмах, тканях или клетках в режиме реального времени с помощью флуоресцентных маркеров. Особое место среди них занимает зеленый флуоресцентный белок СГР, его варианты и гомологи. Главными преимуществами СГРподобных белков при их использовании являются высокс1я стабильность и способность к формированию хромофора без участия кофакторов, ферментов или какихлибо субстратов, кроме молекулярного кислорода 1, 2. Таким образом, возникает возможность образования хромофора и возникновения свечения непосредственно в живых организмах, тканях или клетках 3. Оказалось, что Ы и Сконцы флуоресцентных белков ГРя доступны для создания гибридных белков, что позволяет осуществлять сшивку флуоресцентного белка с белкоммишенью. При этом флуоресцентный белок ГР нс оказывает влияние на локализацию и функцию исследуемого белка. Это свойство делает СГРиодобные белки уникальными генетически кодируемыми флуоресцентными маркерами, которые стали незаменимыми инструментами для изучения взаимодействия белков, их локализации и гранспорта 4, 5, а также биосенсоров внутриклеточных метаболитов, позволяющих определять концентрацию Саг и цЛМФ, , мембранный потенциал, активность некоторых ферментов например, каспаз, киназ и иротеаз в живой клетке 6, 7, 8. Разработаны методы, позволяющие детектировать взаимодействия между интересующими белками 9, . Клонирование генов СГРподобных белков, флуоресцирующих в желтой, оранжевой, красной и дальней красной областях спектра, явилось очередным этапом в использование флуоресцентных белков при проведении исследований в области биологии И. Одновременное использование нескольких ГРб с разными спектральными характеристиками привело к развитию современных методов исследований, позволяющих изучение многофакторных процессов в живой клетке и многоклеточном организме . Последующие научные исследования посггрансляционной химии, структуры и свойств СГРподобных белков позволили разработать подходы к созданию новых флуоресцентных белков с улучшенными и даже заданными свойствами, которые нашли свое применение в биотехнологии и микроскопии . Научная новизна полученных результатов.