Пространственная динамика образования фибринового сгустка при активации иммобилизованным тромбопластином

• Автор: Фадеева, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

1.1. Методы иммобилизации биополимеров.

1.1.2. Методы нековалентной иммобилизации

1.1.3. Методы ковалентной иммобилизации

1.2. Применение иммобилизованных биополимеров

1.3. Белок тканевой фактор.

1.3.1. Структура тканевого фактора.

1.3.2. Функционирование тканевого фактора

1.3.3. Регуляция экспрессии тканевого фактора

1.3.4. Биологические функции тканевого фактора.

1.4. Тромбопластин в методах исследования свертывания крови

1.5. Постановка задачи.

Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы.
2.2. Доноры крови
2.3. Подготовка плазмы крови.
2.4. Приготовление пленок с монослоем фибробластов.
2.5. Получение геля на основе альбумина
2.6. Получение геля на основе альбумина с добавлением в состав геля тромбопластина.
2.7. Получение геля на основе полиэтиленимина
2.8. Получение геля на основе полиэтиленимина и альбумина
2.9. Получение геля на основе полиэтиленимина и альбумина с добавлением метилцеллюлозы.
2 Получение геля на основе полиэтиленимина и альбумина с добавлением в состав геля тромбопластина.
2 Получение геля на основе полиакриламидного геля, в состав которого
включен тромбопластин.
. Приготовление полиакриламидного геля
. Введение тромбопластина в состав полиакриамидного геля
2 Получение пленки для активации поверхности с дальнейшей иммобилизацией тромбопластина.
2 Метод иммобилизации тромбопластина на пластиковую поверхность
2 Определение плотности тканевого фактора на поверхности
2 Определение функциональной константы диссоциации К5 комплекса
2 Определение параметров пространственного роста сгустка в плазме, крови.
Глава 3. Результаты
3.1. Подбор реагентов для получения полимерного геля, в состав которого включен тромбопластин.
3.1.1. Разработка геля на основе альбумина, стабилизированного
глутаровым альдегидом.
3.1.5. Разработка геля на основе альбумина с добавлением в его состав тромбопластина
3.1.2. Разработка геля на основе полиэтиленимина
3.1.3. Разработка геля на основе полиэтиленимина и альбумина
3.1.4. Разработка геля на основе альбумина и полиэтиленимина с добавлением метилцеллюлозы
3.1.5. Разработка геля на основе полиэтиленимина и альбумина с добавлением в состав геля тромбопластина
3.1.6. Разработка геля на основе полиакриламидного геля, в состав которого включен тромбопластин
3.2. Разработка и оптимизация метода ковалентной иммобилизации тромбопластина
3.2.1. Подбор состава пленки для активации поверхности
3.2.2. Оптимизация условий иммобилизации тромбопластина.
3.3. Сравнение кинетических характеристик иммобилизованного тромбопластина с тканевым фактором фибробластов.
3.3.1. Получение разной плотности тканевого фактора на поверхности пластика.
3.3.2. Кинетика связывания тканевого фактора с фактором Vi
3.3.3. Сравнение пространственной динамики роста фибринового сгустка в плазме крови при активации свертывания иммобилизованным тромбопластином и тканевым фактором фибробластов.
3.3.4. Исследование зависимости параметров роста сгустка от плотности тканевого фактора
3.3.5. Хранение активаторов с иммобилизованным тромбопластином
Глава 4. Обсуждение.
Список литературы.
Список сокращений
АА акриламид
БАА ,1Чметиленбисакриламид
ГА глутаровый альдегид
ГНЦ Гематологический Научный Центр Российской академии
РАМН медицинских наук
СТ i iii ингибитор фактора Ха
ГГААГ полиакриламидный гель
ПСА персульфат аммония
ПЭГ полиэтиленгликоль
ПЭИ полиэтиленимин
ПЭТ полиэтилентерефталат
ТЕМЕД , , гетраметилендиамин
ТФ тканевой фактор
фУ фактор VII
фХ фактор X
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
функциональная константа диссоциации комплекса VIIТФ
Введение


В традиционных тестах по исследованию сверхывания, активаторы добавляются в объем плазмы и все активно перемешивается. В результате доминирующими оказываются реакции только первой стадии. Нарушения в остальных стадиях обнаруживаются такими методами довольно плохо. Разработанный в лаборатории физической бпохпмсти ГНЦ РАМН метод и прибор для исследования пространственной динамики свертывания плазмы крови, позволяет наиболее полно смоделировать ту пространственную ситуацию, в которой кровь свертывается непосредственно в кровеносном сосуде 8. В основе метода лежит активация свертывания на. Появление и пространственный рост сгустка от активатора регистрируется по светорассеянию методом темного поля. При этом можно измерять такие важные характеристики процесса как скорость роста, размер сгустка, образование спонтанных сгустков информацию, которая недоступна гомогенным методам 7,8,. Это позволяет одновременно и независимо регистрировать нарушения на всех стадиях процесса. Таким образом, например, было показано, что при классических гемофилиях, когда генетически дефектен один из факторов свертывания, нарушения происходят в фазе роста сгустка, но не активации свертывания. Такая технология является дорогостоящей и трудоемкой и вряд ли может стать основой для проведения рутинных исследований. Поэтому перед нами встала задача разработать ту часть экспериментальной установки, которая имитирует зону повреждения стенки сосуда. Таким элементом измерительной кюветы является пластинка, на поверхности которой должен находится иммобилизованный тромбопластин. В дальнейшем будем называть се активатором свертывания. Нужно было разработать активатор свертывания, сравнимый по способности активировать свертывание с поверхностью покрытой фибробластами, но более удобный в применении и стабильный при хранении. Существует два основных метода иммобилизации белков физический сорбция, и химический ковалентнаясшивка. Мы выбрали химический метод иммобилизации, так как при этом достигается более прочное закрепление белка на поверхности. Кроме того, иммобилизованные таким образом белки, как правило, гораздо более стабильны. Известны многочисленные способы иммобилизации белков на поверхностях различной природы. Один из наиболее распространенных подходов это химическая модификация поверхности. Например, обработка стеклянной поверхности 3аминопропилтриэтоксисиланом приводит к связыванию с поверхностью стекла молекул, имеющих в своем составе первичные аминогруппы. В дальнейшем, эти группы ковалентно связываются с белками . Описан способ нитрования поверхности из полистирола нитротетрафторборатом в тетраметиленсульфоне с последующим восстановлением нитрогрупп хлоридом олова II, также приводящий к образованию на поверхности первичных аминогрупп . Другой подход состоит в формировании на поверхности пленки из полимера, содержащего в своем составе активные группы, например, аминогруппы. В этом случае уже не столь важно, поверхность из какого материала находится под пленкой, что позволяет иммобилизовать белок практически на любой поверхности. Описан способ подготовки носителя для иммобилизации белков, который включает осаждение полиамина на носителе типа неорганической окиси пористого стекла, кремнезема и обработку покрытого полимером носителя бифункциональным реактивом глутаровым альдегидом, который образует поперечные сшивки в полиамине с целью его закрепления на носителе в виде однородной пленки . Недостатком этого метода является то, что хорошая, пленка образуется только на тонкоизмельченных макропористых поверхностях с сильно развитой поверхностью. На гладких поверхностях такая пленка не держится и растрескивается. Это метод был взят нами за основу и модифицирован так, чтобы получить активатор с иммобилизованным тромбопластином. Исследовать пространственную динамику роста фибринового сгустка при активации свертывания иммобилизованным тромбопластином и тканевым фактором фибробластов. Научная новизна. Разработан и оптимизирован, метод получения активатора свертывания с иммобилизованным тромбопластином.