Влияние теплового шока на репликацию ДНК, стабильность генома и структуру хроматина

• Автор: Величко, Артём Константинович
• Шифр специальности: 03.01.03, 03.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

X. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Уровни системного ответа организма на тепловой стресс

1.1.1. Клеточн ый уровень.

1.1.1.1. Мембраны.

1.1.1.2. Цитоскелет

1.1.1.3. Цитоплазма и клеточные органеллы

1.1.1.4. Тепловой шок и клеточная смерть.

1.1.1.5. Клеточный цикл

1.1.2. Молекулярный уровень

1.1.2.1. Белки и факторы теплового шока

1.1.2.2. Т ранскрипция и метаболизм РНК
1.1.2.3. Репарация ДНК.
1.1.2.4. Репликация
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.2. Материалы.
2.2.1. Клеточные линии.
2.2.2. Антитела
2.2.3. Химические реактивы.
2.3. Методы
2.3.1. Культивирование клеток человека.
2.3.2. Включение аналогов нуклеотидов
2.3.3. Иммуноцитохимия.
2.3.4. Выделение РНК.
2.3.5. Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени на матрице кДНК
2.3.6. Приготовление белковых экстрактов
2.3.6.1. Приготовление клеточных экс фактов
2.3.6.2. Приготовление ядерных экстрактов.
2.3.6.3. Экстракция гистонов
2.3.7. Вестернблот гибридизация
2.3.8. Анализ чувствительности к ДНКазе 1.
2.3.9. Проточная цитофлуориметрия.
2.3 ЗКонцевое мечение ДНК с использованием терминальной
дезоксинуклеотидилтрансферазы.
2.3 Никтрансляция i i мечение ДНК с использованием ДНКполимеразы I
2.3 Получение препаратов ДНКнитей i
2.3 РНКинтерференция.
2.3 Метод ДНКкомет гельэлектрофорез одиночных клеток
2 Нейтральная версия
2 Щелочная версия.
2 И.ммунофлуоресцентная версия.
2.3 Метод оценки жизнеспособности клеток МТТтсст.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Роль белка гетсрохроматина 1 в клеточном ответе на тепловой стресс
3.1.1. Кратковременный тепловой стресс не влияет на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток человека
3.1.2. Белок гетерохроматина 1 1 а диссоциирует из центромерных областей хромосом в условиях теплового стресса.
3.1.3. Диссоциация 1 а из центромерных участков хромосом не связана с
деметилированием остатков лизина 9 гистона НЗ НЗК
3.1.4. Диссоциация НР1 а не приводит к декомпактизации центромериых участков
3.1.5. Обсуждение результатов.
3.2. Роль гистона уН2АХ в клеточном ответе на тепловой стресс
3.2.1. Тепловой шок индуцирует фосфорилирование гистона ШАХ в клетках человека
3.2.2. Профиль распределения Н2АХ, индуцированного тепловым шоком, зависит от стадии клеточного цикла.
3.2.3. Тепловой шок индуцирует формирование двуцепочечных разрывов ДНК в 1 и 2ix.
3.2.4. Тепловой шок оказывает пропорциональный своей силе эффект на репликацию ДНК
3.2.5. Молекулы Н2АХ. формирующие О и И.фокусы, фосфорилируются с помощью
разных киназ.
3.2.6. Фосфорилирование Н2АХ предотвращает коллапс репликативных вилок.
3.2.7. Обсуждение результатов
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
Список сокращений
эксцизионная репарация оснований xii i
5бромо2дезоксиуридин
I 4,6диамидино2фенилиндол
модифицированная Дульбекко среда Игла
ii i
ДНКзависимая иротеинкиназа
5ЭТИНИЛ2 дезоксиуридин
гомологичная рекомбинация ii
элементы теплового шока
факторы теплового шока
белки теплового шока i
эксцизионная репарация нуклеотидов i xii i
негомологичное соединение концов ДНК ii
фосфатносолевой буфер
РИСК фосфатидилинозитол3киназоподобные киназы iii 3i i
фенилметилсульфонилфлуорид i i
белок репликации ii i
гельэлектрофорез одиночных клеток i i
I короткие диспергированные повторы I
V этопозид
БСА бычий сывороточный альбумин
гяРНП гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиновые комплексы
ДМСО диметилсульфоксид
дТФ дезоксирибонуклеозидтрифосфат
ДСН додецилсульфат натрия
ДТТ дитиотриэтол
ДЦР двухцепочечный разрыв ДНК
миРНК малые интерферирующие РНК
мяРНП малые ядерные рибонуклеопротеиновые комплексы
ПВДФ поливинилиденфторид
ПЦР полимеразная цепная реакция
т.п.н. тысяч пар нуклеотидов
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
Введение


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. X. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Клеточн ый уровень. Мембраны. Тепловой шок и клеточная смерть. Репарация ДНК. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Материалы. Клеточные линии. Химические реактивы. Культивирование клеток человека. Иммуноцитохимия. Выделение РНК. Приготовление клеточных экс фактов
2. Приготовление ядерных экстрактов. Анализ чувствительности к ДНКазе 1. Проточная цитофлуориметрия. РНКинтерференция. Щелочная версия. И.ммунофлуоресцентная версия. Метод оценки жизнеспособности клеток МТТтсст. Белок гетерохроматина 1 1 а диссоциирует из центромерных областей хромосом в условиях теплового стресса. Обсуждение результатов. Профиль распределения Н2АХ, индуцированного тепловым шоком, зависит от стадии клеточного цикла. Тепловой шок индуцирует формирование двуцепочечных разрывов ДНК в 1 и 2ix. Молекулы Н2АХ. О и И. Фосфорилирование Н2АХ предотвращает коллапс репликативных вилок. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. Считается, что первичными сенсорами температуры в клетке являются
белки. Температурная дисфункция белков обусловлена нарушением термолабильных водородных связей и неполярных гидрофобных взаимодействий, дестабилизацией аспиралей и структур, приводящей к нарушению вторичной и третичной конформаций белков. Для предотвращения денатурации в отпет на стресс, клетки запускают экспрессию белков теплового шока от англ. Однако изменение транскрипционного статуса клетки при тепловом шоке отнюдь не Офаничивается повышением экспрессии II. В ряде работ продемонстрировано усиление или, наоборот, уменьшение прекращение экспрессии различных фупп генов в условии гипсртсрмического стресса 5, 6. Если за специфическую активацию транскрипции при тепловом стрессе ответственны факторы теплового шока от англ. Мы предположили, что в процессе индуцированного стрессом сайленсинга генов могут участвовать структурные белки гетерохромагина, и в частности белок . В первой части работы, мы попытались ответить на вопрос, какова функциональная динамика белка I, его роль в эпигенетическом конфолс и масштабной транскрипционной репрессии генов в клетках человека при гипертермии. ДНК также является мишенью для высоких температур. Исследования последних лет демонстрируют, что гипертермия индуцирует фосфорилирование гистона ШАХ но 9 серину 8.