Выделение и характеристика ДНК-полимеразы δ из яйцеклеток и эмбрионов костистой рыбы вьюн (Misgurnus fossilis L. )

• Автор: Дмитриева, Светлана Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.30
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с.

Активные формы кислорода ОН, , Н2, перекиси и радикалы липидов, окись азота, то есть молекулы, в которых он неполностью восстановлен, приводят к повреждению оснований, дезоксирибозы и индукции новых ковалентных связей сшивок i, . Последовательности в ДНК являются горячими точками окислительных повреждений, при этом образуется модифицированное производное гуанина 8оксогуанин 8x i . При дефекте в репаративной системе клетки пара 8x замещается парой ТА, что приводит к изменению контекста генетической информации. Если в обеих цепях ДНК апуриновые или апиримидмновые участки АРсайты располагаются друг против друга или фрагментация дезоксирибозы произошла вблизи, то появляются двунитевые разрывы ДНК vi . Продуктом повреждений, вызванных уоблучением, часто является фрагментированный или окисленный АРсайт. Вполне понятно, что для устранения столь обширного разнообразия повреждений в ДНК требуются различные механизмы. В настоящее время известно несколько основных типов репарации ядерной ДНК эукариот. Эксцизионная репарация эксцизионная репарация основания и эксцизионная репарация нуклеотидного остатка. Первая характерна для устранения модифицированных оснований, АРсайтов и одноцепочечных разрывов ДНК, вторая для устранения неспаренных нуклеотидных остатков и пиримидиновых димеров , , . Необходимым условием восстановления изначальной первичной структуры дуплекса путм эксцизионной репарации является наличие информации интактной комплементарной цепи, считываемой репаративными ДНКполимеразами. В этом случае повреждение удаляется, а образовавшаяся в результате вырезания брешь заполняется ДНКполимеразой в ходе реиаративного синтеза, после чего разрыв в цепи ДНК лигируется. Репарация двухцепочечных разрывов ДНК. Существуют два пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК гомологичная рекомбинация при наличии последовательности ДНК, комплементарной разорванным концам, и соединение негомологичных концов . Репарация межцепочечных сшивок ДНК. Следует отметить, что ряд повреждений клетка способна удалять из ДНК путм прямой реактивации. Типичные ферменты такой репарации ДНКфотолиаза бактерий, которая способна расшивать циклобутановое кольцо пиримидинового димера, и т0ДНК. Прямая реактивация повреждений в ДНК не нуждается в участии реиаративных ДНКполимераз, поэтому она не рассматривается детально в этом обзоре для дополнительной информации см. Эксцизионная репарация основания ЭРО. Существуют данные об ЭРО, связанной с застраиванием однонуклеотидной бреши, что обычно наблюдается в случаях образования нормального АРсайта i, и ЭРО, в ходе которой ДИКполимеразы заполняют брешь из нескольких до нуклеотидов i, зачастую связанной с репарированием аномального АРсайта i, . Д1I, застраивающий брешь 5 зашивание разрыва ДНКлигазой. Так как сайты образуются достаточно часто в клетке вследствие спонтанной или индуцированной потери основания, интересной представляется идентификация ферментов, эффективно обеспечивающих репарацию данного типа. Были предприняты попытки установить, какие из известных ДНКполимераз способны участвовать в эксцизионной репарации пары синтетического олигомера iv . Показано, что такой тип неправильного спаривания в экстрактах клеток Е. ДНКполимеразой , на что указывает ингибиторный анализ с использованием афидиколина, 2 и . Так как репарация сопровождалась образованием однонуклеотидной бреши, авторы предположили, что удаление происходи при помоши не экзонуклеазы, а дезоксирибофосфодиестеразы. Участие ДНКполимеразы в ЭРО подтверждено в экспериментах по реконструкции системы репарации i vi с использованием клеток семенников быка i , . В грубом ядерном экстракте репарация пары подавлялась поликлональными антителами к ДНКполимеразе и ее 8кДа домену, а также при полном исключении из среды . Правильная замена нуклеотида происходила при внесении препаративно очищенной ДНКполимеразы в реакционную смесь, содержащую частично очищенные компоненты фракций, обладающие урацилДНКгликозилазной, АРэндонуклеазной и лигазной активистами. Практически никакой активности в данной системе не проявляли ДНКполимеразы 5 или е.