Миогенная и нейрональная дифференцировка клеток личинок мидии Mytilus trossulus in vivo и in vitro

• Автор: Дячук, Вячеслав Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.30
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Жизненный цикл и миогенез .

1.2. Жизненный цикл и миогенез . .

1.3. Жизненный цикл и миогенез двустворчатых моллюсков

1.4. Анатомия мышц взрослых двустворчатых моллюсков.

1.5. Маркеры мышечной дифференцировки.

1.6. Анатомия мышц личинок моллюсков

1.7. Нейрогеиез личинок моллюсков.
1.8. Роль белков, участвующих в сборке толстых филаментов.
1.9. Роль эластичных белков в сборке саркомеров.
1 Роль белков тонких филаментов в сборке саркомеров.
1 Миофибриллогенез позвоночных животных.
1 Миогенная и нейрональная дифференцировка клеток беспозвоночных i
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
3.1. Животные.
3.2. Получение актомиозиновых экстрактов мидии.
3.2.1. Выделение актомиозиновых экстрактов аз яйцеклеток и личинок мидии и приготовление проб для электрофореза
3.2.2. Выделение актомиозиновых экстрактов из переднего аддуктора взрослых животных и приготовление проб для электрофореза.
3.3. Электрофорез в 8 полиакриламидном геле в присутствии додсцилсульфата натрия ДСН
3.3.1. Приготовление геля.
3.3.2. Условия разделения и окрашивания гелей.
3.4. Количественный анализ белков, разделенных электрофорезом.
3.5. Получение поликлональных антител кролика к белкам толстых нитей гладких мышц мидии
3.6. Иммуноблоттииг.
3.7. Процедура получения первичной культуры клеток мидии
3.7.1. Фракционирование клеток личинок мидии в градиенте Перколла.
3.8. Антитела.
3.9. Иммунохимия
3 Сканирующая конфокальная лазерная микроскопия и обработка
изображений.
3 Определение пролиферативной активности клеток i vi
31. Детекция БДУ в культуре клеток мидии
32. Выявление активности щелочной фосфатазы в культуре клеток мидии
4.1. Выделение тотальной РНК и ее очистка.
4.1. ОГПЦР
4.2. Статистическая обработка полученных данных.
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. МИОГЕНЕЗ I VIV.
4.1.1. Экспрессия мышечных белков мидии М.
4.1.1.1. Изменение состава мышечных белков в онтогенезе мидии.
4.1.1.2. Количественная оценка соотношения основных белков мышц личинок и взрослых моллюсков
4.1.2. Анализ экспрессии твитчина на разных стадиях развития мидии
4.1.3. Детекция парамиозина в раннем эмбриогенезе мидии.
4.1.4. Морфологический анализ развивающейся мышечной системы
4.1.5. Локализация мышечных и нейрональных элементов на ранних стадиях
развития мидии
4.2. МИОГЕНЕЗ I VI
4.2.1. Первичная культура клеток личинок мидии М. .
4.2.2. Пролиферация клеток на разных субстратах.
4.2.3. Выявление активности щелочной фосфатазы
4.2.4. Миофибриллогенез i vi
4.2.5. Миогенная и нейрональная дифференцировка в первичной культуре клегок
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. МИОГЕНЕЗ I VIV.
4.1.1. Анализ белкового состава мышц личинок мидии
4.1.2. Миогснная и нейрональная дифференцировка личинок мидии М.
4.2. МИОГЕНЕЗ I VI
4.2.1. Поведение клегок в культуре
4.2.2. Миофибриллогенез.
4.2.3. Миогенная и нейрональная дифференцировка клеток в культуре мидии .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Гладкие мышцы моллюсков это одна из общепринятых модельных систем для изучения регуляции мышечного сокращения и, в частности, механизма запирательного тонуса, регулируемого нейромедиаторами , . Сердцевину толстых нитей таких мышц образует белок парамиозин i, , на поверхности которого расположены миозин i . . Vi . Предполагают, что фосфорилированис твитчина регулирует запирательный тонус гладких мышц двустворчатых моллюсков i . . Свойства мышц взрослых моллюсков интенсивно изучаются уже более лет. Однако данные о времени начала дифференцировки, образования зрелых мышечных волок и последующего формирования мышечной системы в онтогенезе моллюска i отсутствуют. Двустворчатые моллюски имеют бифазный жизненный цикл, в котором взрослому животному предшествует стадии свободно плавающих личинок. Очевидное эволюционное преимущество такого цикла повышенная выживаемость и лучшее расселение потомков. Развитие некоторых двустворчатых моллюсков изучено на уровне электронной микроскопии , , Малахов, Медведева, , i, Флячинская, Кулаковский, , но детальное изучение мышц личинок двустворчатых моллюсков с применением современных методов биохимии и иммунологического маркирования ранее не предпринимались, а данных о взаимодействии мышечной и нервной систем, особенно на ранних этапах развития, отсутствуют. Использование первичной культуры клеток личинок мидии i и современных адекватных маркеров дифференцировки могут помочь заполнить белые пятна в исследовании основных этапов развития мышечной и нервной систем моллюсков. Целью работы было изучение закономерностей дифференцировки мышечных клеток, формирования мышечной системы и сб взаимосвязи с нервной системой в раннем онтогенезе мидии i . Выяснить, возможно ли воспроизведение миогенной и нейрональной программ дифференцировки в первичной культуре клеток полученной из личинок мидии прсмиогенных стадий развития. Впервые установлено, что парамиозин белок толстых нитей мидии присутствует в кортексс неоплодотвореиных яйцеклеток мидии М. Другие белки толстых нитей, твитчин и миозин, экспрессируются одновременно в первых мышечных клетках личинок мидии и задолго до начала формирования мышечной системы личинки мидии велигера. Мышцы взрослого моллюска закладываются на стадии раннего велигера и развиваются параллельно с мускулатурой личинки. Показано, что поперечнополосатые миофибриллы появляются на ранних стадиях развития личинок. Обнаружена кардинальная перестройка мышечной системы личинки во время метаморфоза, в результате которой развивается полноценная гладкая мускулатура взрослых моллюсков, способная к состоянию запирательного тонуса. Показано, что первые нервные клетки появляются раньше мышечных клеток личинок двустворчатых моллюсков. Миогенная и нейрональная программы, запускаемые в раннем онтогенезе моллюсков, могут быть реализованы в культуре клеток, полученных из личинок прсмиогенных стадий развития. Миогенная программа, воспроизведенная i vi, сходна с таковой i viv и в обоих случаях протекает без формирования многоядерных миотуб в отличие от миогенеза позвоночных животных. Полученные маркеры дифференцировки мышечных клеток и тестированные в экспериментах маркеры нейрогенеза могуг быть использованы для анализа нейро и миоанатомии личинок и взрослых беспозвоночных животных и могут представлять интерес для специалистов, изучающих процессы дифференцировки клеток как i viv, так и i vi. Разработанные условия долговременного культивирования позволят проводить различные молекулярнобиологические манипуляции, для изучения механизмов индукции и ингибирования дифференцировки клеток. Методические разработки и часть результатов работы включены в программу лекций и практических занятий спецкурса Теоретические и практические основы культивирования клеток морских беспозвоночных животных для студентов Отделения биохимии и биотехнологии ЛЭМББТ ДВГУ.