Изучение взаимодействия белков, участвующих в инициации транскрипции РНК-полимеразой II у Drosophila melanogaster

• Автор: Лебедева, Любовь Александровна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 90 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Аппарат транскрипции у эукариот

1. Промоторы генов класса II.

ТАТАБОКС
ИНИЦИАТОР
,.

2. РНКполимераза II

3. Транскрипционные факторы.

Щ II.
II.
II.
МЕДИАТОР
4. Представления об инициации транскрипции iv viv
II. Хроматин. Модификация хроматина гистонацстилтрансферазами.
1. супсрссмсйство
, Е1рЗ, Нра2,
5 и его гомологи.
уНАТА2 комплекс
комплекс
комплскс
2. семейство.
2 и 3 2
3 комплекс
4
ТрбО.

3. 0 семейство.
4. Основные факторы транскрипции , обладающие активностью.
5. Гистонацетилтрансферазы, родственные гормонам
3.
III. Гены теплового шока как модельная система
1. Строение промотора. .
2. Факторы теплового шока.
3.Транскрипция генов теплового шока на примере гена .
4. Реинициация транскрипции.
5. Гранулы теплового шока..
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
I. Объект и задачи исследования.
II. Материалы и методы
1. Реактивы.
2. Антитела.
3. Работа с дрозофилами.
4. Выделение геномной ДНК.
5. ПЦР в реальном времени.
6. Хроматиниммунопреципитация ХСЫР
7. Выделение РНК и Нозернблот анализ.
8. Иммунопреципитация.
9. Хроматографическая очистка и Всстсрн блот анализ.
. Иммуноокрашивание политенных хромосом.
III. Результаты.
1. Анализ экспрессии генов 2 и 2 у .
Нозернблот анализ полиАРНК на разных стадиях развития дрозофилы.
Вестсрнблот анализ.
2. Анализ комплексов, в состав которых входят 2 и 2.
Имунопрсципитация.
Хроматографическая очистка
Иммуноокрашивание политенных хромосом.
3. Исследование участия общих транскрипционных факторов и 5II содержащих комплексов в активации транскрипции на модели гена i viv
Иммуноокрашивание политенных хромосом . дикого типа.
Иммуноокрашивание политенных хромосом трансгенной линии .
Хроматиниммунопреципитация.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Активация транскрипции у эукариот многоступенчатый процесс со сложной координированной регуляцией. Для обеспечения доступности специфических геномных локусов для РНК полимеразы II II в контексте хроматина необходимо взаимодействие основных факторов транскрипции, геноспецифических активаторов и различных кофакторов транскрипции. Изучение механизма взаимодействия основных компонентов транскрипционного аппарата в процессе экспрессии того или иного геномного локуса является одной из наиболее интересных областей современных исследований в области регуляции транскрипции. В настоящее время установлено, что для инициации транскрипции необходимы так называемые общие факторы транскрипции комплексы, обладающие постоянным белковым составом и участвующие в транскрипции основной части генов. В частности, в области промотора собирается большой преинициаторный комплекс, в свою очередь состоящий из нескольких мультибелковых комплексов, основным из которых является комплекс II, содержащий в своем составе белок ТВР и ассоциированные с ним белки I i . Кроме II в состав преинициаторного комплекса входят белок II, необходимый для фиксации II на старте транскрипции комплекс II, обеспечивающий вхождение II в преинициаторный комплекс комплекс II, обладающий АТФазиой активностью и гиперфосфорилирующий II при переходе ее от инициации к элонгации комплексы II и I, стимулирующие сборку преинициаторного комплекса, а также комплекс Медиатор, необходимый для активированной транскрипции. В активации транскрипции на хроматиновой матрице не менее важную роль играют комплексы, участвующие в постгрансляционной модификации гистоиов. Одна из наиболее хорошо изученных модификаций ацетилирование высококонсервативных концов гистонов гистоацстилтрансфсразами . ДНК. Многочисленные исследования выявили прямую связь между ацетилированием гистонов и активацией транскрипции. Таким образом, исследование белков и комплексов, обладающих II активностью, имеет большое значения для понимания процессов, проходящих при активации транскрипции у эукариот. Одним из наиболее хорошо изученных комплексов, является комплекс дрожжей, содержащий в своем составе 5 гистонацстилтрансферазу 5 , белки, белки, а также некоторые из белков , которые, как было указано выше, одновременно являются компонентами основного прсинициаторного комплекса II. Гомологи 5 были найдены у дрозофилы и человека. Комплекс, содержащий 5 был охарактеризован у человека, однако у дрозофилы, аналогичный комплекс обнаружен не был. Настоящая работа посвящена исследованию комплекса i и изучению взаимодействия общих факторов транскрипции РНК полимеразы II, в активации экспрессии локуса . I. Аппарат транскрипции у эукариот. I кодируют 5,8, и рибосомальныс РНК и транскрибируются РНКполимеразой I. II кодируют все матричные РНК и ряд малых ядсрных РНК и транскрибируются РНКполимсразой И. III кодируют II, 5 и некоторые малые цитоплазматические РНК и транскрибируются РНКполимезой III. В данном обзоре рассматривается система транскрипции генов класса II и процесс ее инициации в частности. Промоторы генов класса II. Процесс инициации транскрипции регулируется в основном с помощью взаимодействий между специфическими элементами последовательностей которые находятся как в районе инициации, так и на различных расстояниях от него, а также набором специфических белков, многие из которых связываются со специфическими последовательностями ДНК. Промотором является цисдействующая активная последовательность ДНК, длиной 0 пар оснований, расположенная перед сайтом инициации гена, с которым может связываться РНКполимсраза и инициировать транскрипцию. Промоторы генов класса II имеют общие специфические последовательности, такие как ТАТА бокс в позиции и СААТбокс в позиции . Гены домашнего хозяйства содержат промоторы с участками, богатыми с консенсусной коровой последовательностью 5 3 .