Новые регуляторные функции концевых последовательностей Р-транспозона и элемента МСР у Drosophila melanogaster

• Автор: Груздева, Наталия Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Характеристика Р элемента

2.1.1. РМ гибридный дисгенез, индукция транспозиций Я элемента

1.1.2. Места инсерций Р элемента

2.1.3. Механизмы влияния инсерции Р элемента на экспрессию генамишени

2.1.4. Условия транспозиции Р элемента. Тканеспецифичность гибридного

дисгеиеза

2.1.5. Свойства транспозазы Рэлемента

2.1.6. Роль белка I в процессе транспозиции Р элемента

2.1.7. Механизмы репарации двухцепочечных разрывов, возникающих после вырезания Р элемента
2.2. Инсуляторы i те
2.2.1. Функции и механизмы действия регуляторных элементов
2.2.2. Структура и функции инсуляторов
2.2.3. Инсуляторы в локусе гена теплового шока
2.2.4. Инсулятор в составе мобильного элемента
2.2.5. Инсуляторные свойства промотора v
2.2.6. Инсулятор в локусе гена
2.2.7. Инсуляторы в локусе гена ЛЬс1Н
2.2.8. Модель, объясняющая функции и механизм явления инсуляции
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.1. Генетические методы
3.1.1. Линии и мутации i , использованные в данной работе
3.1.2. Трансформация эмбрионов i те и получение трансгенных линий
3.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов и iii в трансгенных
линиях
3.1.4. Генетические скрещивания
3.2. Биохимические методы
3.2.1. Выделение ДК из дрозофилы
3.2.2. Саузернблотанализ
3.2.3. Метод полимеразной цепной реакции ГИДР.
3.2.4. Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов
3.2.5. Молекулярное клонирование
3.2.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами
3.2.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса
3.2.8 Создание конструкций
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Роль последовательностей Дэлемента в регуляции экспрессии
4.1.1. Четыре копии наружной части пн инвертированных повторов ответственны за высокий уровень экспрессии генаv ву2 аллеле
4.1.2. Рфрагмент активирует транскрипцию гена на том же уровне и на тех же стадиях развития, что и энхансеры гена
4.1.3. Концевые последовательности элемента необходимы для активации экспрессии
4.1.4. Две копии IГКШ1 сильно активируют экспрессию гена
4.2. Новые функции регуляторного элемента МСР как модулятора взаимодействий между энхансерами и промотором
4.2.1. Регуляторный элемент МСР способен частично блокировать экспрессию генов,
находясь между энхансерами и промотором
4.2.2. Взаимодействие между двумя регуляторными элементами МСР приводит к образованию репрессорного домена и, в то же время, улучшает коммуникацию между энхансером и промотором вне этого домена
4.2.3. Регуляторный элемент МСР и инсулятор нейтрализуют блокирующие свойства друг друга
4.2.4. Регуляторный элемент МСР функционирует в зависимости от ориентации 4 2.5. В основе явления нейтрализации инсуляции и сайленсинга и поддержании
взаимодействия между энхансером и промотором лежат белковые взаимодействия с участием белков , 4, и
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1 Потенциальная роль белка I в активации гена с помощью НКИ
5.2. Возможная роль ВТВ доменов в инсуляции и в образовании взаимодействия между энхансером и промотором
5.3. Потенциальная роль белка I для проявления антиинсуляторной функции МСР
5.4. Возможные механизмы действия регуляторных элементов в локусе гена
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


При этом внутренние части химерното элемента, содержащие регуляторные последовательности, могут позитивно или негативно влиять на экспрессию рядом расположенного гена. В результате химерные элементы могут с высокой эффективностью влиять на экспрессию рядом расположенного гена, что может играть роль в эволюции регуляторных последовательностей гена. Следовательно, выяснение механизмов, условий возникновения химерных элементов и их роли в регуляции экспрессии генов является важной и актуальной задачей. Также, перспективным является использование химерных элементов для анализа взаимодействия между регуляторными элементами на больших дистанциях. Химерные элементы удобны как модельные системы, так как можно получать любые изменения как внутри химерного элемента, так и инверсии между химерным элементом и Рэлсмснтом, расположенным на небольшом расстоянии. Таким образом, в настоящее время мобильные элементы находят все большее применение как удобные инструменты для манипуляции с геномами с целью выяснения закономерностей протекания различных генетических процессов и создания генноинженерных конструкций. В определении взаимодействий между энхансерами и промоторами важную роль могут играть инсулягоры и сайленссры. В то же время репрессирующее действие сайленсеров не зависит от пространственного расположения по отношению к энханссру или промотору. Одной из интересных регуляторных систем является локус гена i , содержащий все три класса регуляторных элементов. Предполагается, что инсуляторы окружают каждый энхансер и организуют ДНК регуляторной области гена В в серию изолированных хроматиновых доменов. При этом в непосредственной близости от инсулятора или даже в его составе находятся так называемые сайты i , участвующие в процессе сайлснсинга, необходимого для нормального развития. В результате, регуляторные элементы, находящиеся между хроматиновыми доменами, с одной сюроны функционируют как границы, а с другой стороны осуществляют функцию сайленсинга, что позволяет поддерживать индивидуальный и независимый паттерн экспрессии гена . Парадоксально то, что энхансер может взаимодействовать с промотором на больших дистанциях, несмотря на присутствие инсуляторов и сайленсеров, и при этом правильно узнавать свой промотор. Таким образом, выяснение механизмов действия инсуляторов и сайленсеров представляет большой интерес, так как позволяет приблизиться к пониманию проблемы взаимодействия между энхансером и промотором в геноме. Кроме того, изучение действия инсуляторов является важной прикладной задачей для создания векторов, которые способны поддерживать стабильную экспрессию генов вне зависимости от места интеграции в геноме. В ых годах, при скрещивании лабораторных и природных линий i , был обнаружен ряд генетических аномалий, таких как высокая степень стерильности самцов и самок, увеличение числа летальных и видимых мутаций, изменение частоты и распределения рекомбинационных событий в хромосомах самок, индукция в норме шефствующей рекомбинации у самцов, нерасхождение хромосом, хромосомные перестройки инверсии и транслокации iii , i ii , V , , i i . Совокупность всех этих нарушений получила название гибридною дисгенеза i . Он происходит в зародышевых клетках и сильно зависит от факторов окружающей среды, в частности от температуры i . Признаки дисгенеза проявляются только в потомстве от скрещивания самцов из так называемых Р линий отцовская линия с самками М линии материнская линия. При реципрокном скрещивании РМ признаков гибридного дисгенеза практически не наблюдается и потомство обладает нормальными генетическими свойствами . Рубин и соав торы в процессе изучения мутаций в локусе i, полученных при РМ гибридном дисгенезе, установили, что большинство из них вызвано инсерциями последовательностей ДНК в район данного локуса. Так был обнаружен новый мобильный элемент, получивший название элемента i . Молекулярное изучение строения элементов показало, что по структуре их можно разделить на два класса полноразмерные элементы и дефектные, имеющие внутренние делении i .